背景:内毒素血症(endotoxemia,ETM)是现代危重症医学面临的重要临床问题,病情凶险,迁延不愈可引起多器官功能障碍综合征,是医院危重症患者死亡的首要原因。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性菌释放的内毒素,作为一种极强的炎症反应刺激物,在ETM的病程发展中起着关键作用。虽然抗生素是目前ETM治疗的基础,但持续强烈的炎症反应限制了它们的有效性,迄今尚无ETM特效诊疗策略。ETM心功能障碍被认为是ETM最严重的综合征之一,以心肌收缩功能受损和顺应性降低为特征,伴随着过度的心脏炎症。在ETM早期病理阶段,LPS诱发细胞内质网(endoplasmic reticulum,ER)Ca~(2+)泄漏,导致平均动脉血压和心率急剧增加;晚期阶段,LPS可直接激活Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)信号通路,下游促炎因子的过度爆发引起细胞因子风暴,造成心肌细胞收缩力下降和致命的心律失常,从而加重心功能障碍。经典瞬时受体电位通道(classical transient receptor potential,TRPC)是Ca~(2+)可通透的非选择性阳离子通道,课题组前期发现TRPC重要地参与ETM心功能障碍的发展,然而其具体作用机制尚未阐明。目的:本课题拟在前期基础上,从动物、组织、细胞到分子水平,多层面系统性阐释TRPC调控ETM心功能障碍的关键分子机制和TRPC活性结构域;基于TRPC活性位点,筛选出高效抑制剂,在体内外多种ETM模型中评价靶向TRPC对ETM心功能障碍的治疗效果,为寻找新的有效治疗靶点和新药开发提供重要的实验依据。方法:(1)TRPC在ETM心功能障碍中的作用:(1)采用LPS腹腔注射构建ETM小鼠模型,Western blot法检测小鼠心肌中TRPC家族蛋白的表达。(2)应用全身性Trpc1敲除和Trpc6敲除小鼠构建LPS诱导的ETM模型,绘制生存曲线,比较小鼠生存时间;采用Power Lab记录仪、超声影像系统评价小鼠心功能;苏木素和伊红(hematoxylin and eosin,H&E)染色法和酶联免疫法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)评价心肌组织病理损伤程度;免疫荧光实验检测心肌组织中TRPC1和TRPC6的分布情况。(3)分离原代成年小鼠心肌细胞和骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMMs),应用Ca~(2+)成像系统检测LPS引起细胞内Ca~(2+)浓度(Ca~(2+)concentration,[Ca~(2+)]_i)的变化。(2)TRPC促进ETM心肌中TLR4介导的炎性级联反应:(1)Trpc1敲除和Trpc6敲除小鼠分别构建ETM模型,应用RNA-seselleckchem JNJ-42756493q对小鼠心肌组织差异表达基因进行聚类和富集分析。(2)采用ELISA和免疫组化实验检测促炎因子(TNF-α、IFN-β、IL-6和IL-1β)和炎性蛋白(MIP-1α)的表达。(3)Western blot法检测NF-κB p65核内表达、MAPK家族蛋白磷酸化,TLR4以及My D88、TRIF依赖通路关键蛋白的表达。(3)TRPC介导Ca~(2+)调蛋白(calmodulin,Ca M)调控TLR4信号通路:(1)分析RNA-seq数据中Ca~(2+)通路显著变化基因。(2)Western blot法和ELISA检测Ca M及下游钙调神经磷酸酶活力和NFAT核内表达;免疫共沉淀实验(co-immunoprecipitation,co-IP)验证TRPC1或TRPC6与Ca M蛋白的结合。(3)采用co-IP、邻位连接技术(proximityligationassay,PLA)、微量热泳动(microscale thermophoresis,MST)和免疫荧光实验在组织、细胞和蛋白水平检测Ca M与TLR4蛋白的结合。(4)在LPS刺激的成年小鼠心肌细胞infection of a synthetic vascular graft和BMMs中,应用Ca M不同结构域抑制剂,筛选Ca M与TLR4的结合域:通过co-IP检测Ca M与TLR4的结合、Western blot法和ELISA检测MAPK家族蛋白磷酸化水平和促炎因子含量。(5)TLR4与Ca M的氨基酸结合位点研究:在HEK-293T细胞中转染Ca M和关键位点突变的TLR4质粒,通过co-IP和免疫荧光技术检测TLR4与Ca M的氨基酸结合位点;Ca M靶蛋白数据库筛选TLR4高评分结合基序,将这些TIR域非典型性异亮氨酸-谷氨酰胺样(isoleucine glutamine,IQ)基序合成TLIQ系列小肽后,采用非变性凝胶电泳和MST筛选Ca M结构中与TLR4结合的序列。(6)应用分子对接虚拟筛选Ca M与TLR4的潜在结合位点。(4)TRPC介导IP3R调控ER/肌浆网(sarcoplasmic reticulum,SR)Ca~(2+)泄漏信号通路:(1)对野生型乳小鼠心肌细胞Itpr1、Itpr2和Ryr2使用si RNA基因沉默和/或抑制剂阻断后,采用Ca~(2+)成像系统检测LPS引起的[Ca~(2+)]_i。(2)对分离野生型、Trpc1/6敲除的成年/乳小鼠心肌细胞进行抑制剂阻断后,采用Ca~(2+)成像系统检测LPS引起的[Ca~(2+)]_i。(3)流式细胞分选技术分离原代心脏留驻巨噬细胞,采用Ca~(2+)成像系统检测LPS引起的[Ca~(2+)]_i。(4)分离野生型小鼠BMMs,对Itpr1使用si RNA敲减或抑制剂阻断后,采用Ca~(2+)成像系统检测LPS引起的[Ca~(2+)]_i。(5)ETM小鼠注射IP3R抑制剂低分子量肝素(low molecular weight heparin,LMWH),采用超声影像系统检测心功能,绘制生存曲线,比较小鼠生存时间。(6)采用co-IP、PLA和免疫荧光实验检测TRPC、IP3R1、Ca M和TLR4蛋白之间的结合。(5)TRPC抑制剂的虚拟筛选与体内外评价:(1)采用SYBYL分子对接软件筛选与TRPC3/6蛋白C端结构域结合的抑制剂;采用MST检测TRPC1 C端融合蛋白与抑制剂的亲和力。(2)在LPS刺激的乳小鼠心肌细胞中给予不同浓度SKF-96365(SKF),进行细胞层面药效评价:采用ELISA检测促炎因子含量,Ca~(2+)成像系统检测[Ca~(2+)]_i,co-IP检测TRPC、IP3R1、Ca M和TLR4蛋白互作情况。(3)LPS诱导ETM小鼠和盲肠结扎穿孔术(cecum ligation and puncture,CLP)诱导脓毒症小鼠分别注射SKF,进行动物层面药效评价:采用超声影像系统检测心功能;H&E染色法评价心肌组织病理损伤程度;ELISA检测血清中心肌损伤标志物和促炎因子含量;绘制生存曲线,并比较小鼠生存时间。结果:(1)TRPC在ETM心功能障碍中的作用:(1)TRPC1和TRPC6是LPS刺激后小鼠心肌中TRPC家族蛋白表达变化最显著的两种亚型。(2)Trpc1/6敲除显著提高ETM小鼠的生存率,明显缓解心功能相关的平均动脉血压、心率和射血分数骤降,显著抑制心肌组织炎性浸润和损伤,说明TRPCs参与了ETM心功能障碍的发生发展。(3)ETM心肌中TRPC1和TRPC6高表达于心肌细胞和巨噬细胞。在有/无Ca~(2+)的细胞外液中,Trpc1/6敲除均显著抑制LPS诱导的BMMs/成年小鼠心肌[Ca~(2+)]_i升高,说明TRPC1/6参与了LPS引发的ER/SR Ca~(2+)释放。(2)TRPC促进ETM心肌中TLR4介导的炎性级联反应:(1)RNA-seq数据分析表明Trpc1/6敲除显著影响先天免疫反应调控中的TLR信号通路。(2)在小鼠心肌中,Trpc1/6敲除显著抑制LPS诱导的促炎因子释放,MIP-1α阳性表达,NF-κB p65的核转位、MAPK家族蛋白和IRF3的磷酸化,TLR4以及My D88、TRIF依赖通路关键蛋白的表达。(3)TRPC介导Ca M调控TLR4信号通路:(1)Trpc1/6敲除导致ETM小鼠心肌中Ca M蛋白表达显著升高,下游钙调神经磷酸酶活力和NFAT3核内表达明显下调;在小鼠心肌中,Ca M与TRPC1和TRPC6明显结合。(2)Trpc1/6敲除的小鼠心肌中,Ca M与TLR4蛋白直接结合。LPS诱导的Trpc1/6敲除的小鼠心肌细胞中,Ca M与TLR4共表达于细胞膜附近。(3)在Trpc1/6敲除的成年小鼠心肌细胞/BMMs中,Ca M的疏水口袋区抑制剂W-7可阻断Ca M与TLR4结合,翻转了Trpc1/6敲除对LPS刺激的炎症通路的抑制作用;而Ca M的E-F手区阻断剂CALP1无此调控作用,说明与TLR4结合的Ca M结构域为其疏水口袋部位。(4)在HEK293T细胞中,Ca M与V693位点突变的TLR4没有互作,说明V693是TLR4与Ca M的结合位点之一。(5)Ca M与TLIQ2小肽表现出非Ca~(2+)依赖的结合,说明TLR4 TIR域的非典型IQ基序段也可以与Ca M结合。(6)Ca M的疏水口袋域的Ala2、Glu8、Asp123、Ile126和Asp130可以与TLR4的αB-αC螺旋中的Poc位点Val693以及TLIQ基序Lys729、Ser730、Arg731、Trp746和Cys747位点结合。(4)TRPC介导IP3R调控LPS诱导的ER/SR Ca~(2+)泄漏信号通路:(1)在成年/乳小鼠心肌细胞中,Ry R2拮抗剂可部分抑制LPS引发的Ca~(2+)释放,Trpc1/6敲除可部分抑制剩余的Ca~(2+)释放,而IP3R拮抗剂可完全阻断Ca~(2+)释放,说明TRPC1和TRPC6参与了IP3R所介导的SR Ca~(2+)释放。(2)在巨噬细胞中,LPS引起的[Ca~(2+)]_i升高被Itpr1敲除显著抑制,被Trpc1/6敲除部分抑制,说明IP3R1是介导ER释Ca~(2+)的主要亚型,TRPC1和TRPC6参与该释Ca~(2+)过程。(3)LMWH不能改善ETM小鼠心肌收缩功能或提高生存率,提示阻断Ca~(2+)释放不足以治愈ETM心功能障碍。(4)LPS刺激后,野生型的心肌中IP3R1与TRPC1/6的互作增加,Trpc1/6敲除心肌中Ca M与IP3R1出现明显互作;W-7翻转了Trpc1/6敲除所抑制的LPS引发的[Ca~(2+)]_i升高。以上结果说明:LPS刺激后,TRPC1/6参与IP3R介导的ER/SR Ca~(2+)释放;Trpc1/6敲除后,与TRPC1/6解离的Ca M可阻断IP3R通道开放。(5)TRPC抑制剂的虚拟筛选与体外活性评价:(BIBW2992体外1)分子对接结果表明:非特异性抑制剂SKF与TRPC3/6的CIRB结构域有结合。(2)SKF与TRPC1 C端融合蛋白的亲和力为K_D=0.65±0.13 m M。(3)在细胞水平,SKF浓度依赖地抑制LPS诱导的促炎因子分泌、心肌细胞[Ca~(2+)]_i升高。(4)在蛋白水平,SKF浓度依赖地抑制LPS刺激后TRPC1/3/6蛋白的表达;降低TRPC1分别与Ca M和IP3R1的结合,明显增加Ca M分别与TLR4和IP3R1的结合。(6)TRPC抑制剂的体内药效评价:(1)LPS诱导的ETM小鼠中,SKF剂量依赖地改善心肌收缩功能障碍、缓解心肌组织病理损伤、抑制血清中心肌损伤标志物和促炎因子分泌。(2)SKF多次给药能显著提高ETM小鼠的生存率。(3)CLP诱导的脓毒症小鼠中,SKF剂量显著改善心肌收缩功能障碍、缓解心肌组织病理损伤,抑制血清心肌损伤标志物和促炎因子分泌,明显提高CLP小鼠生存率。结论:本论文系统分析并阐明了TRPCs直接参与并促进ETM心功能障碍的关键病理发生机制。首次明确了Trpc1或Trpc6敲除可通过解除其与分子伴侣Ca M的结合,阻断巨噬和心肌细胞的TLR4受体激活,对My D88和TRIF依赖性炎症通路均产生抑制作用,同时阻断LPS导致的细胞ER/SR Ca~(2+)泄漏,从而产生显著的LPS所致心功能障碍的保护作用。值得一提的是,TRPC抑制剂SKF可通过作用于TRPC上的Ca M/IP3R结合域,在LPS诱导的小鼠ETM和CLP模型中均显示出强大的心脏保护作用,并显著降低死亡率。研究证实了TRPCs是ETM治疗的潜在新靶点,并为ETM治疗提供了一种潜在的高效特异性新方法。