研究目的天然免疫是机体抵御病毒入侵的第一道防线。机体免疫反应的激活和调控机制精密而复杂,三基序蛋白(tripartite motif protein)家族在天然免疫信号通路的激活调控中发挥重要作用。TRIM50是TRIM蛋白家族的新成员,其在天然免疫中的作用尚未阐明,本研究目的在于探究TRIM50对抗病毒天然免疫反应的调控效应及其分子机制,为阐明抗病毒免疫机制和控制病毒感染奠定基础。研究方法为探究TRIM50在抗病毒免疫反应中的作用,我们用单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)和水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)感染 WT 和 Trim 50-/-的小鼠腹腔巨噬细胞,用qPCR、ELISA、Western blot、病毒空斑检测等技术检测TRIM50对小鼠巨噬细胞抗病毒免疫反应的影响。用双荧光素报告基photobiomodulation (PBM)因检测和免疫共沉淀筛选抗病毒免疫通路中与TRIM5NSC125066半抑制浓度0相互作用的分子,并用免疫荧光分析其在细胞内的共定位情况。通过免疫沉淀、泛素化分析等对TRIM50调控靶分子的机制进行深入探索。构建小鼠病毒感染模型,检测TRIM50对体内抗病毒免疫反应的调控作用。研究结果1.TRIM50负向调控抗病毒免疫反应用HSV、VSV感染来源于WT和Trim50-/-小鼠的腹腔巨噬细胞,发现Trim50-/-巨噬细胞产生的IFN-β水平更高,抗病毒信号通路中P-TBK1、P-IRF3水平更高,抗病毒能力更强,提示TRIM50在抗病毒免疫反应中发挥负向调控作用。2.TRIM50与TBK1相互作用双荧光素报告基因检测结果显示,TRIM50对RIG-Ⅰ和cGAS介导的抗病毒免疫反应都发挥负向调控作用。免疫共沉淀筛选和免疫荧光分析显示,TRIM50能够与抗病毒通路关键分子TBK1相互作用,并且随着病毒感染进程其相互作用逐渐增强。3.TRIM50通过招募BRCC3介导去除TBK1的K63位泛素化修饰TRIM50对TBK1的调控机制研究显示,TRIM50通过降低TBK1的K63位泛素化水平发挥对抗病毒免疫反应的负向调控效应。靶点筛选和免疫共沉淀验证结果显示,TRIM50与BRCA1/BRCA2的复合亚基3(BRCA1/BRCA2-Containing Complex Subunit 3,BRCC3)形成复合物共同负向调控TBK1的K63位泛素化修饰。泛素化分析结果显示,敲除BRCC3能够逆转TRIM50对TBK1 K63位泛素化修饰的抑制作用,提示TRIM50通过BRCC3发挥对TBK1的K63位去泛素化作用。而BRCC3酶活性缺失突变体的泛素化分析结果显示,BRCC3依赖其去泛素化酶活性发挥对TBK1的K63位去泛素化作用。4.TRIM50通过募集BRCC3发挥对抗病毒免疫反应的负向调控效应用Brcc3 SiRNA构建BRCC3敲低的小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMDM)细胞模型,病毒感染结果显示,与对照组相比,BRCCselleck产品3敲低组IFN-β的水平显著上调,表明敲低BRCC3能够增强抗病毒免疫反应。构建TRIM50和BRCC3同时敲低的BMDM细胞模型,病毒刺激结果显示,TRIM50通过BRCC3发挥对抗病毒免疫反应的负向调控作用。5.TRIM50负向调控小鼠的抗病毒免疫反应用HSV和VSV感染小鼠,以构建小鼠病毒感染模型。检测小鼠血清及各脏器中IFN-β的水平和病毒含量,结果显示Trim50-/-小鼠体内IFN-β水平更高,病毒滴度更低,生存期更长,进一步验证了 TRIM50对小鼠抗病毒免疫反应的负向调控效应。研究结论和创新性1、TRIM50在抗病毒免疫反应中发挥负向调控效应。2、TRIM50与TBK1相互作用,并通过抑制TBK1的K63位泛素化修饰,进而调控TBK1的活化水平。3、TRIM50通过招募BRCC3介导TBK1的K63位去泛素化作用,负向调控抗病毒免疫反应。