苦马豆素(Swainsonine,SW)是一种有毒生物碱,能引发牲畜患疯草病,制约草原畜牧业发展,但同时也是一种潜在的抗肿瘤药物。产SW的真菌含SWN基因簇,其基因产物在SW生物合成途径上由哌啶酸(Pipecolic acid,PA)合成SW的过程中发挥重要作用,本研究在课题组前期基础上,进行Alternaria oxytropis OW7.8和swn K ACP结构域敲除株的代谢组学分析、swn H1基因功能对SW合成影响分析、swnR基因的克隆和功能研究载体的构建,为探索该真菌中SW生物合成分子机理和代谢途径提供基础数据。主要研究结果如下:1.对A.oxytropis OW7.8和swn K ACP结构域敲除株进行代Erdafitinib纯度谢组学分析,筛选到8个与SW合成相关的差异代谢物:L-Pipecolic acid、L-Lysine、L-Stachydrine、L-Proline、L-Glutamate、α-Aminoadipic Semialdehyde、Saccharopine、N-Acetylglucosamine-1-phosphate,水平均上调。2.利用实时荧光定量PCR检测A.oxytropis OW7.8在不同时间(14 d、16 d、18 d、20 d、22 d)下实验组[添加1,2-二羟基吲哚里西啶(1,2-dihydroxyindoliziPD0325901体内ne)]和对照组菌丝体中swn H1基因表达水平,结果显示:随时间延长,实验组swn H1基因表达水平持续上升,对照组从第16 d开始持续上升;实验组水平从第16 d开始高于对照组。3.利用HPLC-MS检测菌丝体中SW水平,结果显示:对照组SW水平在20 d前变化平缓,在第22 d有较大提升;实验组在18 d后持续上升,对照组14～18 d高于实验组,20 d后实验组高于对照组。4.利用PCR克隆了A.oxytropis OW7.8的swnR基因及c DNA序列,自ATG至TGA全长918 bp,无内含子,编码305 aa;预测Swn R酶蛋白分子式为C_(1568)H_(2418)N_(420)O_(456)S_(13),分子量为34865.77 Da,p I为6.15,属亲水性蛋白,无信号肽和跨膜结构域,大概率定位于细胞质。5.分别扩增swnR基因上、下游序列和潮霉素磷酸转移酶基因(hph),利用重叠PCR构建基因敲除片段,由上游同源区(432 bp)+hph(1394 bp)+下游同源区(449 bp)构成,将敲除片段与p MD~(TM)19-T载体连接,构建出swnR基因敲除载体。6.提取OW7.8总RNA,利用RT-PCR扩增swnR的c DNA,用Bam HⅠ和XmalⅠ对该c DNA与载体p BARGPE1-Hygro进行双酶切后连接,构建出swnR基因过表达载体optimal immunological recovery,其启动子为gpd A、终止子为Trp C、选择标记基因为hph。7.根据sg RNA设计引物,从PFC334载体扩增sg RNA表达盒的上下两个片段,通过无缝克隆连接至PFC332载体,构建出swnR基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体。