卤化物是农业、制药业和化学工业的重要原料,含有卤素取代基的化合物常具有新活性或强药理功效,但传统的化学合成途径具有环境不友好、反应条件苛刻、区域选择性差和合成效率低的缺点。生物酶法由于其高选择性和特异性更符合绿色生产需求和社会发展的需要。其中,黄素依赖型卤化酶(FDH)是天然卤化物生物合成途径的关键酶之一,其分布广泛,具有底物特异性和卤化位点选择性,是最具开发潜力的卤化酶。课题组前期从巴丹吉林沙漠中分离到了1株热丁香链霉菌SPC6(Streptomyces thermolilacinus SPC6),从该菌中分离得到了1个含氯元素的抗生素streptochlorin。通过前期研究发现,卤化酶Scl T是该抗生素生物合成过程中的一个核心合成酶之一。因此,本研究采用隐马尔可夫模型预测分析了目前报道的已知分离源的链霉菌中FDH的多样性;运用生物信息学方法分析热丁香链霉菌SPC6中卤化酶Scl T的酶学性质;对卤化酶Scl T及其辅酶进行异源表达,实现了卤化酶Scl T体外酶促反应;在热丁香链霉菌SPC6中构建卤化酶Scl T基因敲除突变株,确定了卤化酶Scl T的酶促反应底物,主要研究结果如下:1.通过自建模型(muti-FDH)对已知来源的374株链霉菌中FDH序列进行了预测,得到5305条FDH序列,其中来自沙漠和污染环境的链霉菌可预测到FDH的数量超均值比例最高,且沙漠环境来源的链霉菌包含全部类型的FDH。因此,沙漠环境来源的链霉菌具有多种卤化物合成潜力,其FDH具有重要的研究价值。2.通过模型预测说明菌株SPC6中卤化酶Scl T属于可使用多种底物的FDH,系统发育分析发现相比于其他已知FDH,卤化酶Scl T单独发育成支,具有特殊性。理化性质分析发现卤化酶Scl T是胞质内可溶蛋白,具有多个磷酸化位点。对该酶的二级结构预测表明卤化酶Scl T具有α螺旋、无规则卷曲交替存在及延伸链均匀分布的特点,蛋白结构稳定。因此,该酶具备进行体外酶促反应的条件。3.为进行卤化酶SclT的体外酶促反应,构建了卤化酶Scl T及其辅酶的重组质粒,在Escherichia coli BL21(DE3)中实现异源表达,获得高浓度纯化蛋白。蛋白序列覆盖率检测结果显示卤化酶Scl T的蛋白序列覆盖率为99.7%,证实其表达无误。检测了辅酶活性,表明其能够还原黄素,为后续卤化酶Scl T的体外酶促反应正常进行奠定基础。基于序列特征和streptochlorin的结构,选择了8种常用FDH底物进行体外酶促反应,发现卤化酶Scl T不以常见简单化合物为底物,在底物选择性上Sublingual immunotherapy与其相近FDH具有较大差异,推测卤化酶Scl T是一种新型FDH。4.为进一步验证卤化酶SclT的催化机制,对菌株SPC6PEG300体内实验剂量构建scl T基因敲除菌株(Δscl T)。通过HPLC代谢指纹图寻找更多谱分析,与野生型(wt)菌株相比,Δscl T突变株存在未反应的多种streptochlorin合成中间体。以Δscl T突变株的发酵产物作为底物与卤化酶Scl T进行体外酶促反应,对比反应前后HPLC代谢指纹图谱发现streptochlorin合成中间体信号峰降低,同时产生了Δscl T突变株的发酵产物中未出现的多个化合物信号峰。证实了卤化酶Scl T以多种streptochlorin合成中间体为底物,该酶具有一定的底物宽泛性,这一发现表明卤化酶Scl T与其他相似的FDH对比,在底物选择上有较大差异,拓宽了对FDH催化活性的研究。综上所述,本研究阐述了链霉菌中黄素依赖型卤化酶的多样性,探究了Streptomyces thermolilacinus SPC6中卤化酶Scl T的催化机制,研究结果为后续对链霉菌中黄素依赖型卤化酶挖掘以及抗生素streptochlorin合成机制的研究奠定了基础。