淋巴瘤源于淋巴造血系统,是我国常见恶性肿瘤之一。尽管现代生物医学在淋巴瘤的诊疗研究中取得了一定进展,诸多临床问题仍有待解决。深入分析淋巴肿瘤疾病特征及致病分子演变,是实现精准分层及个体化精准诊疗的重要研究手段。弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)作为成人B细胞淋巴瘤中常见的亚型,在遗传学特征、免疫表型、临床表现等方面异质性较高。尽管新型免疫治疗使DLBCL患者的长期生存率明显提高,仍有约1/3的患者初治耐药或缓解后复发,造成了极大的社会负担。探索DLBCL致病分子靶点,阐明分子生物学功能和调控机制,将为精准靶向治疗提供新型分子靶点。基因组测序结果显示B细胞恶性转变过程中发生了体细胞超突变,揭示了DLBCL细胞基因组不稳定的特点。脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate,dNTP)池动态平衡在维持DNA复制、启动DNA损伤修复中至关重要。含 SAM 和 HD 结构域蛋白-1(SAM domain and HD domain-containing protein-1,SAMHD1)是真核细胞中常见的三磷酸水解酶,是维持核苷酸池动态平衡的关键调节分子。SAMHD1的异常表达与基因突变、DNA损伤修复、周期调控、DNA损伤通路激活密切相关。环状GMP-AMP合成酶(cGAS)-干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes,STING)通路是感知DNA损伤的通路,具有抗微生物感染、调控免疫反应、介导细胞死亡等作用。该通路活化可诱导坏死性凋亡、凋亡、焦亡等细胞死亡形式,多种细胞死亡途径的交互作用又名“泛凋亡”。研究发现,靶向激活STING能显著抑制肿瘤生长,并可以增强抗肿瘤免疫治疗的疗效。尽管STING激动剂在肺癌、卵巢癌等实体瘤的临床试验中效果显著,STING在DLBCL中的功能与机制尚不明确。本研究旨在探究SAMHD1及其介导的STING通路在DLBCL中的作用及机制。研究结果揭示了 SAMHD1调控STING活化以及STING介导泛凋亡的机制,将为患者提供一个抗淋巴瘤治疗的新选择。第一部分SAMHD1在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达及功能研究目的:DLBCL是非霍奇金淋巴瘤的常见亚型,具有高度的异质性。目前,仍有约1/3的DLBCL患者难治、复发或原发耐药,且无法通过新型靶向药物、细胞治疗等挽救治疗获得完全缓解。筛选DLBCL致病分子靶点,探究分子生物学功能及调控机制,有望提高患者的治疗反应率。DLBCL具有基因组不稳定性的特征,靶向DNA损伤修复可以增强治疗疗效。SAMHD1是一类三磷酸水解酶,主要参与DNA损伤修复、细胞周期、免疫调控等生物学过程。然而,SAMHD1在DLBCL中的表达水平、生物学作用及临床意义未明。本研究旨在阐明SAMHD1在DLBCL中的表达特征与功能。研究揭示了DLBCL组织中SAMHD1的表达水平,分析了 SAMHD1阳性表达与患者临床特征及治疗反应的相关性。同时,使用人源DLBCL细胞株探究SAMHD1对细胞活力的影响,以期为抗淋巴瘤治疗提供新的靶分子。材料与方法:1.在Oncomine、TCGA数据库中进行生物信息学分析;2.收集初治DLBCL及反应性增生的淋巴结组织石蜡样本,统计临床信息;3.组织切片进行免疫组织化学染色(immunohistochemistry,IHC);4.收集初治DLBCL及健康供者的外周静脉血,提取单个核细胞;5.外周血CD19+B细胞免疫磁珠流式分选及纯度检测;6.DLBCL细胞株培养;7.蛋白质免疫印迹法(western blot,WB)检测蛋白表达水平;8.慢病毒介导SAMHD1基因过表达与敲减;9.CCK-8法检测细胞活力;10.SCID Beige小鼠构建移植瘤模型;11.统计学分析。结果:1.公共数据库分析发现,DLBCL组织中SAMHD1 mRNA表达水平明显提高。IHC证实,DLBCL患者淋巴结组织中SAMHD1蛋白表达高于反应性增生淋巴结组织。据统计,DLBCL淋巴结组织中SAMHD1阳性率达60%(60/100),反应性增生淋巴结组织仅有35%(7/20)。2.临床资料分析发现,SAMHD1阳性患者具有血清LDH降低、B症状缺失的临床特征。生存分析显示,与SAMHD1阴性患者相比,SAMHD1阳性患者的总生存期降低。然而,SAMselleck HPLCHD1差异表达与患者治疗反应率无显著相关。3.在SAMHD1阳性的人源DLBCL细胞(LY1,LY3)中稳定转染SAMHD1过表达慢病毒(LV-SAMHD1)及SAMHD1敲减慢病毒(SAMHD1-KD),使用CCK-8法对细胞活力进行检测。研究发现,SAMHD1表达水平与细胞活力呈正相关。小鼠移植瘤模型显示,敲减LY1细胞中SAMHD1的表达可显著抑制肿瘤体内生长。结论:SAMHD1在DLBCL中高表达,与患者不良预后相关,提示SAMHD1具有DLBCL患者预后评估的潜能。SAMHD1过表达能提高细胞活力,而分子表达缺失可抑制细胞生长。上述结果表明,SAMHD1有望作为分子靶向治疗的新靶点。第二部分 沉默SAMHD1诱导的STING在弥漫大B细胞淋巴瘤中介导泛凋亡目的:研究显示,SAMHD1能够保持基因组的稳定性,以此抑制先天免疫反应通路的异常活化。cGAS-STING通路是先天免疫反应中特殊的胞质DNA损伤感知通路,具有激活先天免疫反应、重塑肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)的功能。此外,靶向激活STING能够诱导细胞死亡,进而抑制肿瘤生长、降低肿瘤负荷。cGAS-STING通路具有强大的抗肿瘤作用,但该通路在DLBCL中的功能与活化方式尚不清楚。本研究旨在探讨DLBCL中STING通路活化及STING调控细胞死亡的机制。研究阐明了沉默SAMHD1诱导DNA损伤、促进STING通路活化的功能,揭示了 STING通过激活MLKL、CASP3及GSDME等死亡效应蛋白介导泛凋亡。研究结果为STING激动剂应用于抗淋巴瘤治疗提供了理论基础。材料与方法:1.CRISPR-Cas9基因编辑技术介导STING敲除;2.转录组测序及生物信息学分析,探究SAMHD1作用机制;3.Annexin V-PE/7AAD 或 Annexin V-FITC/PI 双重染色检测细胞凋亡;4.免疫荧光(immunofluoreLY294002供应商scence,IF)染色检测蛋白表达水平;5.彗星实验检测胞内DNA片段;6.乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒测定细胞LDH释放水平;7.电镜观察细胞形态;8.慢病毒介导的STING过表达、SAMHD1敲减细胞株构建;9.CCK-8法检测细胞活力;10.WB检测死亡通路有关的蛋白表达;11.统计学分析。结果:1.流式细胞学检测发现,SAMHD1表达缺失后,DLBCL细胞的凋亡率显著增加。此外,SAMHD1缺失的DLBCL细胞表现出多种细胞死亡的形态,并伴有LDH释放水平增加。2.转录组测序证实,SAMHD1敲减后LY1细胞上调了 DNA损伤修复、双链断裂等功能。进一步研究证实,敲减SAMHD1表达后DLBCL细胞中DNA损伤标记物H2A.X表达水平、双链DNA的丰度显著增高。3.基因表达富集分析显示,SAMHD1敲减后STING相关的胞质DNA损伤通路的表达上调,其中,STING、RIPK1/3、ASC等细胞死亡相关基因的转录水平显著增高。4.慢病毒转染建立STING过表达细胞株,并利用CRISPR-Cas9技术敲除STING表达。STING过表达的DLBCL细胞出现细胞膜肿胀,而STING敲除后细胞形态则无显著改变。流式细胞学分析显示,细胞凋亡率随着STING表达水平增加而升高。此外,细胞LDH释放水平随着STING表达水平增高而增高。进一步研究Chromogenic medium发现,STING过表达显著抑制细胞活力,反之,STING敲除明显增加细胞活力。5.WB结果显示,STING过表达促进MLKL、CASP3、GSDME蛋白活化,以此介导泛凋亡。反之,STING敲除降低了 p-MLKL、cleaved-CASP3、GSDME-N的蛋白表达水平。此外,STING敲除可以抑制由SAMHD1敲减所诱导的效应蛋白活化。结论:敲减DLBCL细胞中SAMHD1的表达可导致DNA损伤及双链DNA累积,进而促进STING通路活化。STING通过激活MLKL、CASP3、GSDME介导泛凋亡。研究结果揭示了 STING在细胞死亡调控中的重要作用,为STING激动剂在淋巴瘤中的应用奠定了基础。第三部分STING激动剂DMXAA增强PD-L1抑制剂在弥漫大B细胞淋巴瘤中的疗效目的:作为DNA损伤感知通路,STING通路在自身免疫疾病、抗肿瘤免疫反应、细胞死亡调控中起到了重要作用。目前,STING激动剂已成为药物研发热点。研究数据表明,STING激动剂联合免疫检查点抑制剂的抗肿瘤疗效显著。程序性死亡受体-1/程序性死亡配体-1(programmed death-1/programmed death ligand-1,PD-1/PD-L1)可作为复发/难治DLBCL的治疗靶点,然而,DLBCL患者对PD-1/PD-L1免疫治疗的反应率存在显著差异。优化现有的DLBCL治疗方案,创新治疗策略,是亟待解决的临床问题。本研究旨在阐明STING激动剂在DLBCL中的应用价值。靶向激活STING能增强PD-L1蛋白在DLBCL细胞中的表达,并能增强新型PD-L1抑制剂对细胞活力及肿瘤生长的抑制作用。研究成果有望为DLBCL患者提供新的治疗策略。材料与方法:1.药物联合实验及联合指数(combination index,CI)计算;2.CCK-8法检测细胞活力;3.WB检测蛋白表达水平;4.BALB/c裸鼠构建小鼠移植瘤模型;5.小鼠皮下成瘤,腹腔注射药物;6.统计学分析。结果:1.CCK-8结果显示,STING激动剂DMXAA对细胞活力具有显著的抑制作用。进一步研究发现,DMXAA治疗诱导了细胞死亡,表现为细胞凋亡率增高、LDH释放水平增高、死亡效应蛋白表达增高。值得注意的是,STING敲除可减轻DMXAA对细胞活力的抑制作用。此外,DMXAA可抑制LV-SAMHD1 LY1细胞的活力。2.WB结果显示,STING过表达后DLBCL细胞上调PD-L1蛋白表达,STING敲除则降低了 PD-L1的表达。随后,在STING差异表达的DLBCL细胞中检测BMS1166的作用。CCK-8结果显示,STING过表达提高了 BMS1166对细胞活力的抑制,而STING敲除减轻了药物作用。3.建立DMXAA与BMS1166药物联合实验,体外联合实验显示,DMXAA与BMS1166具有药物协同作用,并可显著抑制LY1细胞增殖。体内实验进一步证实,与BMS1166单药治疗相比,DMXAA联合BMS1166能显著抑制LY1细胞的体内生长。结论:STING激动剂DMXAA在DLBCL中诱导细胞死亡,降低细胞活力。靶向激活STING提高了 DLBCL细胞中PD-L1的蛋白表达水平,以此增强BMS1166对细胞活力的抑制作用。STING激动剂联合PD-L1抑制剂具有显著的抗淋巴瘤作用。研究结果为提高PD-L1免疫治疗的疗效提供了新型治疗策略。