背景:肺癌在全球范围内仍然是威胁人类生命和健康的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率也是居高不下,且呈逐年上升的趋势,寻找能够有效诱导肺癌细胞死亡的药物并弄清楚其作用的分子机制对于肺癌治疗有着重要意义。近年来,随着中医药的不断研究,天然化合物在肿瘤治疗中显示出了不可替代的优势,也因其有效性强和副作用较小等优势具备良好的开发和应用价值。S-3′-羟基7′,2′,4′-三甲氧基异黄烷(S-3′-hydroxy-7,2′,4′-trimethoxyisoxane,ShtIX)是从海南降香乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物中分离并进行结构鉴定的一个新异黄烷化合物,具有抗肿瘤活性,但其具体的分子机制尚不清楚。铁死亡(Ferroptosis)是2012年由Scott J.Dixon等首次报道的一种区别于凋亡和坏死的铁依赖性的细胞死亡方式。铁死亡作为一种新的调节性细胞死亡模式,在肿瘤细胞发生发展中发挥着重要的调控作用,诱导肿瘤细胞铁死亡可能会为癌症的治疗提供新思路和新策略。核因子E2相关因子2(Nuclear Factor erythroid 2-Related Factor 2,Nrf2)是机体抵抗内外界氧化和化学刺激的防御性转导通路,Nrf2表达异常与肿瘤发生发展、化疗耐药及不良预后密切相关。血红素加氧酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)是Nrf2的主要下游靶蛋白。在细胞铁死亡过程中,几乎所有调节铁死亡的基因都与Nrf2有关,Nrf2表达的水平与铁死亡的敏感性密切相关。目前,越来越多的证据表明有些天然化合物具有促进肿瘤细胞发生铁死亡的作用,且能以铁死亡的方式发挥抗肿瘤作用,然而其具体的分子机制需要进一步研究和证实。本研究旨在探究ShtIX的抗肿瘤活性及其诱导肺癌细胞死亡的具体分子机制,为肺癌治疗提供新的候选药物和策略。目的:通过体内外实验明确ShtIX对肺癌具有抗肿瘤活性,能够以铁死亡方式诱导肺癌细胞死亡,揭示Nrf2/HO-1途径在ShtIX诱导肺癌细胞铁死亡中的机制。方法:1.MTT和CCK-8法检测ShtIX对所选肿瘤细胞的IC_(50)值及细胞活力;细胞克隆形成实验和Ed U实验检测ShtIX对肺癌细胞增殖的影响;台盼蓝拒染实验和LDH乳酸脱氢酶细胞毒性实验检测肺癌细胞死亡情况;流式细胞术检测细胞周期情况。2.荧光显微镜检测ShtIX对细胞凋亡形态的影响;流式检测ShtIX对肺癌细胞凋亡数量的影响;western blot检测凋亡相关蛋白的表达情况。利association studies in genetics用上述方法检测不同死亡模式的抑制剂对细胞活力和死亡的影响,确定ShtIX诱导肺癌细胞死亡的方式。3.电镜观察ShtIX处理的肺癌细胞是否有铁死亡的形态特征;试剂盒检测ShtIX处理后肺癌细胞中Fe~(2+)、MDA和GSH的含量;流式检测ROS和lipid ROS的生成情况;westeD-Lin-MC3-DMA临床试验rn blot检测铁死亡相关蛋白的表达水平;利用上述方法检测铁死亡抑制剂Fer-1对肺癌细胞铁死亡的影响。4.ShtIX处理前后的肺癌细胞送公司进行RNA高通量测序,筛选出基因表达差异显著的基因Nrf2和HO-1;q RT-PCR和western blot对基因表达情况进行验证;利用上述方法检测干扰或过表达Nrf2对肺癌细胞活力和铁死亡的影响。5.构建动物模型,测量裸鼠成瘤体积和肿瘤重量,检测铁死亡相关指标和Nrf2/HO-1的表达情况,体内判断ShtIX是否通过抑制Nrf2/HO-1途径诱导了肺癌细胞的铁死亡。结果:1.ShtIX对肺癌细胞的细胞毒作用最强与所选的其他肿瘤细胞系相比,ShtIX对肺癌细胞系(A549)细胞的细胞毒作用最强。2.ShtIX可以抑制肺癌细胞增殖并诱导其死亡ShtIX显著抑制了肺癌细胞细胞的活力和增殖,诱导了肺癌细胞死亡,可将细胞周期抑制在G0/G1期。3.凋亡不是诱导肺癌细胞死亡的主要模式检测凋亡相关指标发现,ShtIX仅在较高浓度下才能导致凋亡的发生,不同细胞死亡抑制剂实验结果显示铁死亡抑制剂(Fer-1和DFO)能够显著逆转肺癌细胞的活力,进一步发现ShtIX处理能够增加肺癌细胞内Fe~(2+)的生成,下调FTH的表达,从而打破铁稳态。4.ShtIX可诱导肺癌细胞发生铁死亡ShtIX处理后肺癌细胞出现了典型的铁死亡形态学特征,造成了ROS和lipid ROS的累积,MDA水平的增加,GSH和GPX4水平的降低,且都可以被Fer-1所逆转。5.ShtIX通过抑制Nrf2/HO-1信号通路诱导肺癌细胞发生铁死亡RNA高通量测序结果显示ShtIX显著下调了Nrf2和HO-1基因的表达,q RT-PCR和western blot检测结果与此一致。RNA干扰Nrf2显著增强了ShtIX诱导的肺癌细胞铁死亡,过表达载体的结果则与此相反,从正反两面证明了ShtIX诱导的肺癌铁死亡的分子机制。6.构Gefitinib-based PROTAC 3建动物模型,体内检测ShtIX的抗肿瘤活性及其分子机制与对照组和铁死亡抑制剂联合组相比,ShtIX处理组的小鼠肿瘤体积和重量都明显减小,ShtIX促进了铁死亡的发生,下调了Nrf2和HO-1的表达,结果与体外实验一致。结论:1.ShtIX可抑制肺癌细胞的活力和增殖,诱导肺癌细胞死亡。2.ShtIX可诱导肺癌细胞发生铁死亡。3.ShtIX可通过抑制Nrf2/HO-1通路诱导肺癌细胞铁死亡。4.ShtIX可体内抑制肿瘤的生长,诱导铁死亡,抑制Nrf2和HO-1的表达。