ROXY1编码一种CC型陆地植物特异性谷氧还蛋白(Glutaredoxin/GRX),主要参与细胞的氧化还原等生命过程,在植物生长发育中发挥着重要作用。bHLH74是bHLH转录因子家族中的一员,在植物中广泛存在,参与植物生长发育、抗逆和抗病等重要生物学过程。我们通过酵母双杂筛选到ROXY1与bHLH74相互作用,为进一步验证它们在植物体内的关系,探索ROXY1与bHLH74在拟南芥发育中的功能,我们进行了双分子荧光互补实验(BiFC)、pull-down体外实验、表达模式及其突变体表Pexidartinib体内实验剂量型分析等,本文主要研究结果如下:1.对ROXY1与bHLH74的相互作用进行了验证。利用体内实验BiFC及体外实验GST-pull down两种不同的实验方法进一步验证了ROXY1与bHLH74的互作关系。2.对bHLH74启动子活动及其蛋白亚细胞定位进行了分析。构建融合GUS报告基因及融合GFP报告基因的表达载体并转化拟南芥,结selleck HPLC果显示bHLH74启动子在柱头、花瓣、叶片、茎生长锥和侧根中均有表达,且在主根中高表达;亚细胞定位发现bHLH74主要在细胞核中分布。bHLH74与ROXY1在根部的表达部位部分重叠,由此推断bHLH74与ROXY1在根中互作,共同参与根的生长发育。3.对ROXY1与bHLH74参与拟南芥根生长发育的生物学功能进行了研究。通过比较roxy1-2,bhlh74-1和bhlh74-2突变体与同一条件下野生型植株根的生长情况,发现roxy1-2,bhlh74-1和bhlh74-2突变体的根均短于野生型,而bhlh74-1 roxy1-2双突变体的根更短。说明ROXY1与bHLH74均参与了拟南芥中根的生长,并对拟南芥根的生长起着正调控作用。4.对bHLH74中重要半胱氨酸进行鉴定与分析。我们利用点突变将bHLH74中的三个半胱氨酸(C75、C101、C242)分别突变为丝氨酸,结果表明只有C242位点突变后,bHLH74(C242S)与ROXY1不再相互作用,也无法拯救bhlh74-1突变体的表型,并且将其大量表达后根也不再变长,以上实验结果说明C242对bHLH74功能的正常发挥至关重Stem cell toxicology要。5.对ROXY1与bHLH74互作的保守性进行了分析。采用BiFC验证了番茄中的ROXY1与番茄中的bHLH74也互作,说明ROXY1与bHLH74这种相互作用在物种间是保守的。同时我们用BiFC还验证了bHLH74自身可形成同源二聚体,与其同源的bHLH49能形成异源二聚体,并且ROXY1与bHLH49也互作。6.为探究bHLH49是否也参与根的发育,通过CRISPR-cas9技术获得了bhlh49突变体。研究发现bhlh49单突变体植株根的长短及形态与野生型无异,但是bhlh74-1 bhlh49双突变体植株的根与bhlh74-1单突变体相比更短,这表明bHLH49也参与了根的生长。7.对ROXY1与bHLH74的下游靶基因进行了分析。利用RNA-seq分析了ROXY1与bHLH74下游靶基因,发现173个基因在roxy1-2与bhlh74-1中均上调,223个基因在roxy1-2与bhlh74-1中均下调,并且bHLH74下游基因中85%又同时被ROXY1调控,而ROXY1中只有24.3%的基因同时位于bHLH74下游,表明两者都参与调控一些相同的生理过程或途径,如苯丙素的生物合成、植物激素信号转导、淀粉和蔗糖的代谢以及MAPK信号通路等过程,进而影响根的生长发育。前期研究报道ROXY1与TGA-b ZIP TF家族成员相互作用参与花器官发育和抗病,而本文研究发现ROXY1与bHLH74相互作用在根中发挥功能,并初步分析了ROXY1与bHLH74共同调控的一些下游靶基因及生物学通路。这些研究结果为全面解析ROXY1和bHLH74共同参与调控根生长发育的分子机制奠定了基础,并对在重要作物中研究同类基因提供了科学依据。