乳腺炎对奶牛的泌乳能力和产奶质量有着重大的影响,长期以来使奶牛养殖业遭受重大打击。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)作为革兰氏阴性菌的外壁,是炎症反应的有效诱导剂。核因子κB受体活化因子配体(Receptor activator of the NF-κB ligand,RANKL)是TNF超家族的重要成员之一。RANKL可能具有抗炎特性,但其分子机制尚不清楚。RANKL是否能在奶牛乳腺上皮细胞炎症中起抗炎作用以及机制也属未知。为获得RANKL过表达奶牛乳腺上皮细胞基因表达谱,本研究对RANKL过表达后的奶牛乳腺上皮细胞进行转录组测序。与对照组相比,共发现3725个差异基因(其中上调基因2740个,下调基因985个),富集在1213条通路上,其中很多代谢通路都与炎症相关。从DEGs中选取17个炎症相关差异基因,利用qRT-PCR进行验证,荧光定量结果与转录组结果一致。为建立奶牛乳腺上皮细胞炎症模型,本研究利用0、5、10、20、50μg/m L LPS分别处理奶牛乳腺上皮细胞,之后利用MTT法检测细胞活力,用qRT-PCR检测炎症因子IL1β、IL6、iNOS、TNF-α的m RNA表达量。实验结果表明,10μg/m L LPS处理奶牛乳腺上皮细胞24 h时,细胞活力显著降低,且IL1β、IL6、iNOS、TNF-α的m RNA表达量显著上调(P<0.05),表明成功建立奶牛乳腺上皮细胞炎症模Liproxstatin-1体内型。为探究RANKL在奶牛乳腺上皮细胞中的抗炎作用及可能机制,本研究利用奶牛乳腺上皮细胞炎症模型,设置对照组,分别利用LPS(10μg/m L)和RANKL(3000 ng)或用两者(LPS+RANKL)共同作用。24 h后收集细胞样品。实验结果如下:(1)利用qRT-PCR检测各处理组IL1β、IL6、iNOS、TNF-α的表达量。结果表明:与对照组相比,LPS处理组的IL1β、IL6、iNOS、TNF-α的表达量显著上调(P<0.05),但LPS+RANKL组与LPS组相比,IL1β、IL6、iNOS、TNF-α的表达量显著降低(P<0.05)。因此,RANKL可以降低LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎症模型中的炎症因子m RNA表达。(2)采用流式细胞术检测各处理组奶牛乳腺上皮细胞凋亡。结果表明:与对照组相比,RANKL过表达组Medical home无明显变化(P>0.05);LPS组显著提高奶牛乳腺上皮细胞凋亡(P<0.05)。与LPS组相比,LPS+RANKL组显著抑制细胞凋亡(P<0.05)。因此,RANKL过表达能抑制LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡。(3)利用NF-κB驱动荧光素酶报告基因检测RANKL过表达对NF-κB磷酸化的作用。结果表明,NF-κB驱动荧光素酶报告基因的细胞在LPS作用下显示荧光素酶活性增加,但显著降低于LPS+RANKL组(P<0.05)。因此,RANKL过表达抑制了LPS诱导的NF-κB磷酸化的作用。(4)利用Western blot检测炎症通路相关蛋白TLR4,My D88,TRAF6,TNF-α,以及NF-κB通路中的P-65,p-P65,RANK以及RANKL。结果表明,LPS组的LPS炎症通路相关蛋白(TLR4,My D88,TRAF6,TNF-α)以及p-P65的蛋白表达量均显著高于对照组(P<0.05),RANKL+LPS组的LPS炎症通路相关蛋白(TLR4,My D88,TRAF6,TNF-α)以及p-P65的蛋白表达量显著低于LPS组(P<0.05)。进一步说明RANKL过表达能降低LPS诱导NF-κB的炎症通路。(5)利用Co-IP验证RANK和TRAF6之间存在的相互作用PD-0332991研究购买,以及TRAF6和TLR4之间存在的相互作用。结果表明,RANK与TRAF6之间发生共沉淀,TRAF6和TLR4之间发生共沉淀。说明RANKL可能对LPS/TLR4信号通路存在作用,有可能抑制了LPS-TLR4经典炎症途径。综上所述,RANKL激活RANK以后,通过结合TRAF6,降低了TLR4、My D88、TNF-α,以及NF-κB通路中的P-65,p-P65,抑制LPS/TLR4经典炎症通路。