由于结构比较简单,且缺乏自身增殖所需的完整酶系统,病毒完全依赖宿主细胞的代谢网络提供能量和生物大分子才能完成增殖。因此,深入研究病毒感染后宿主细胞的代谢重塑对揭示病毒的感染机制与药物靶标挖掘具有重要意义。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是严重危害全球养猪业的重要病原之一,其基因组具有高度变异的特性,导致现有疫苗难以提供有效的免疫保护,急需开发其它防控技术与产品。中心碳代谢(CCM)包括糖酵解、三羧酸(TCA)循环和磷酸戊糖途径,是机体所需能量的主要来源,并为其它代谢途径提供代谢物质前体。以前的研究发现,许多病毒通过调控CCM促进病毒增殖。鉴于CCM在细胞中的重要生理功能及其在病毒感染中的作用,使其成为重要的抗病毒靶点。但是,目前关于PRRSV感染如何调控CCM尚不清楚。本研究聚焦PRRSV与CCM的相互作用研究,以期筛选出具有临床应用前景的抗PRRSV药物靶标。主要研究内容与结果如下:1.PRRSV劫持宿主细胞CCM促进自身增殖葡萄糖和谷氨酰胺是细胞的主要碳源,能够为生命活动提供能量和碳骨架。本研究发现,PRRSV感染增加细胞对葡萄糖和谷氨酰胺的摄取;同时,剥夺葡萄糖和/或谷氨酰胺显著抑制PRRSV增殖,说明PRRSV感染促进葡萄糖和谷氨酰胺的摄取以优化病毒增殖。葡萄糖和谷氨酰胺主要通过CCM途径被分解代谢。CCM抑制剂实验显示,限制葡萄糖和谷氨酰胺进入CCM显著拮抗PRRSV增殖,说明通畅的CCM有利于PRRSV增殖。进一步研究发现,PRRSV感染激活糖酵解(增加葡萄糖摄取和乳酸分泌、上调乳酸脱氢酶活性),并且维持TCA循环通量(维持乙酰辅酶A的丰度);同时,糖酵解或TCA循环抑制剂均能拮抗PRRSV增殖,说明糖酵解和TCA循环是优化PRRSV增殖所需的代谢通路。此外,外源添加TCA循环中间代谢物α-酮戊二酸(α-KG)能部分回复谷氨酰胺缺失所抑制的PRRSV增殖。上述研究结果表明,PRRSV感染促使细胞摄取更多的葡萄糖和谷氨酰胺进入糖酵解和TCA循环以增加病毒增殖,提示糖酵解和TCA循环是控制PRRSV感染的潜在药物AG-221分子量靶标。2.PRRSV nsp1β通过稳定HIF-1α表达促进糖酵解鉴于PRRSV感染激活糖酵解促进自身增殖,为了挖掘糖酵解途径中潜在的抗PRRSV药物靶标,进一步分析了PRRSV如何激活糖酵解途径。通过重新分析本实验室前期已开展的PRRSV感染IPAM细胞(永生化猪肺泡巨噬细胞)的转录组学数据,发现PRRSV感染后多条代谢通路被显著富集,包括糖酵解通路和缺氧诱导因子1α(HIF-1α)通路。HIF-1α是调控糖酵解的重要转录因子,但其是否参与PRRSV诱导糖酵解仍不十分清楚。因此,首先对转录组学数据进行验证,发现PRRSV感染上调HIF-1α表达。过表达HIF-1α上调PRRSV诱导的糖酵解通量;干扰HIF-1α下调PRRSV诱导的糖酵解通量,说明HIF-1α参与PRRSV诱导的糖酵解。随后,筛选参与调控HIF-1α表达的PRRSV编码蛋白,发现PRRSV非结构蛋白1β(nsp1β)显著上调HIF-1α的表达,并且nsp1β通过其N端酶活促进HIF-1α转录,通过其C端酶活抑制HIF-1α的泛素化降解。进一步研究发现,nsp1β与HIF-1α以及介导HIF-1α泛素化降解的von Hippel-Lindau tumour suppressor protein(p VHL)均存在相互作用并形成三元复合物。有意思的是Immunohistochemistry,nsp1β通过招募p VHL稳定自身表达,同时又抑制p VHL对HIF-1α的泛素化降解。此外,nsp1β还促进乳酸脱氢酶活性,说明nsp1β能上调糖酵解通量。上述研究结果表明,nsp1β通过稳定HIF-1α表达激活糖酵解,说明HIF-1α有望成为控制PRRSV感染的潜在药物靶标。3.PRRSV利用糖酵解终产物乳酸促进自身增殖因为PRRSV感染产生大量乳酸,而最近的研究发现乳酸并不是一种“代谢废弃物”,而是组蛋白乳酸化修饰的底物,参与调控多种生物学进程,包括干扰素(IFN)反应、炎症发生、肿瘤形成等,但乳酸是否调控PRRSV介导的IFN反应和组蛋白修饰尚不清楚。通过外源添加乳酸,发现乳酸具有促进PRRSV增MG132殖的作用;而乳酸抑制剂培黄素(Galloflavin)处理显著抑制PRRSV增殖;而且PRRSV感染诱导的乳酸促进细胞组蛋白乳酸化修饰。采用CUT&tag和RNA-sequence关联分析挖掘PRRSV感染诱导乳酸化修饰的潜在下游效应分子,发现PRRSV诱导的乳酸化修饰激活热休克蛋白70家族蛋白6(HSPA6)的表达,而且还发现HSPA6具有负调控IFN-β的特性并促进PRRSV增殖。进一步分析了HSPA6负调控IFN-β的作用机制,证实HSPA6通过抑制肿瘤坏死因子受体相关蛋白3(TRAF3)和核因子κB抑制蛋白E(IKKε)之间的相互作用,从而负调控IFN-β产生。上述结果表明,PRRSV通过调控乳酸—乳酸化修饰—HSPA6—IFN-β轴促进自身增殖,因此,乳酸抑制剂有望成为拮抗PRRSV感染的候选药物。4.TCA循环代谢物衣康酸显著抑制PRRSV增殖先前的研究结果证实PRRSV感染维持TCA循环通量以优化病毒增殖。为了挖掘TCA循环中潜在的抗PRRSV代谢物,重新分析了本实验已开展的PRRSV感染IPAM细胞的非靶向代谢组学数据,发现在TCA循环方面,PRRSV感染仅上调TCA循环主链代谢产物顺乌头酸的表达。但是,外源添加顺乌头酸却不影响PRRSV增殖。进一步分析了PRRSV感染上调顺乌头酸丰度却不影响病毒增殖的原因,发现PRRSV感染下调顺乌头酸代谢酶免疫应答基因1(IRG1)的表达和IRG1代谢产物衣康酸的丰度,说明PRRSV感染通过下调IRG1的表达减弱顺乌头酸的消耗,从而导致顺乌头酸的累积。进一步采用衣康酸衍生物4-辛基衣康酸(4-OI)分析衣康酸对PRRSV增殖的影响,发现4-OI处理显著抑制PRRSV增殖,主要抑制病毒的吸附、复制和释放环节。同时,还发现4-OI通过上调PRRSV抑制的核因子2相关因子2(Nrf2)的表达减弱PRRSV诱导的炎症因子表达。由于4-OI既能抑制PRRSV增殖,又能抑制PRRSV诱导的炎症因子产生,提示4-OI可能是一种有应用前景的抗PRRSV药物。综上所述,本研究通过分析PRRSV感染对CCM的影响,发现PRRSV感染激活细胞糖酵解和维持TCA循环通量,且两者均是优化PRRSV增殖所需的代谢通路,提示糖酵解和TCA循环有可能成为控制PRRSV感染的药物靶标;证实PRRSV通过稳定HIF-1α表达促进糖酵解通量,提示HIF-1α可能成为控制PRRSV感染的药物靶标;发现糖酵解终产物乳酸可优化PRRSV增殖,说明乳酸抑制剂是潜在的PRRSV拮抗药物;确定TCA循环代谢物衣康酸可显著抑制PRRSV增殖和PRRSV诱导的炎症因子表达,表明其有可能成为临床上控制PRRSV感染的候选药物。