蛋白激酶C(Protein Kinase Dorsomorphin体外C,PKC)是一类对蛋白质的丝氨酸和苏氨酸残基进行磷酸化修饰的蛋白激酶,按照结构特点分为经典PKC、新型PKC和非经典PKC三种亚型。蛋白激酶Cα(PKCα/PRKCA)属于经典PKC家族。研究表明PKCα是昼夜节律的重要调节因子,PRKCA基因的突变与人类精神疾病如自闭症谱系障碍和精神分裂症紧密相关,然而对于PRKCA在调节动物情绪行为方面的作用及其内在机制仍不明确。由于基因组部分加倍,斑马鱼prkca基因在进化中产生了两个旁系同源基因prkcaa和prkcab,分别位于第6和第3号染色体上。斑马鱼Prkcaa和Prkcab分别包含670和671个氨基酸,其序列一致性高达87%。这两个基因在除肝脏外的所有组织中均有一定表达,但表达模式有所不同,prkcaa在卵巢中表达水平最高,其次Y-27632采购是眼睛和脑组织;prkcab在脑组织的表达量最高,其次是眼睛和鳃。在293T细胞中进行过表达Prkcaa和Prkcab,发现Prkcaa仅定位于细胞质中,而Prkcab在细胞质和细胞膜中均有定位。为了进一步研究prkcaa基因在调控动物社会行为的作用和机制,我们采用CRISPR/Cas9技术构建了prkcaa基因缺失的斑马鱼突变体模型,并获得“-2 bp”和“-11 bp”两种突变品系,分别命名为zko3145A和zko3145B。prkcaa基因缺失不影响斑马鱼在正常条件下的生长、发育和繁殖。以prkcaa敲除突变体为模型分别进行新型水箱实验、镜像攻击实验、社交偏好实验和集群实验,研究Prkcaa在调控鱼类行为中的作用。新型水箱实验结果显示:prkcaa纯合突变体进入新型水箱上层的潜伏期(P<0.001)、总次数(P<0.001)以及在上层停留时间(P<0.001)均显著低于WT,呈现出现类似焦虑的行为表型;镜像攻击实验结果显示:突变体进入接近区(Approcah area,AA)的次数(P<0.01)显著降低,镜前咬合时间(P<0.01)、频率(P<0.001)均明显降低,说明突变体在镜前的攻击/攻击性趋势行为明显减少;社交偏好实验中突变体与WT之间对同种群体的偏好值具有极显著的差异(P<0.001);突变体鱼在集群实验中表现出更松散、更大的鱼群,体现在平均鱼间距离(P<0.001)、平均近邻距离(P<0.001)、群体面积(P<0.001)的增加,此外离群频率(P<0.001)也显著增加,代表鱼群游泳方向一致性的极化值也显著降低(P<0.001),表明Prkcaa的缺失导致斑马鱼的社交能力产生缺陷。以上结果表明,斑马鱼prkcaa在对斑马鱼情绪行为调控中具有重要的作用。为Biobehavioral sciences探究Prkcaa在调控鱼类行为改变的作用机制,我们采用RNA-seq方法分别检测了WT和3145A突变体脑组织在早晨(9:00 AM)和夜间(9:00 PM)的基因表达情况。对基因表达数据进行主成分分析的结果显示,斑马鱼的基因型(WT与3145A)和采样时间(夜间/早晨)对基因表达均有明显影响。对差异表达基因进行韦恩分析发现,有175个昼夜节律基因受到prkcaa突变的影响,包括44个夜间偏好的基因(在夜间有更高的表达,GS1)和131个早晨偏好的基因(在早晨有更高的表达,GS2)。独立性G检验分析结果表明,prkcaa的突变对早晨偏好基因的表达有明显的影响(P<0.001),但对夜间偏好基因没有明显影响(P=0.1045)。代表性egr2a,egr4a,fosaa,fosab和npas4a等即时早期基因,它们在夜间的下调由于Prkcaa功能障碍有所减弱。这些基因同时也与神经系统发育和神经活动显著相关。与之一致的是,prkcaa突变体表现出昼夜运动节律的颠倒,夜间活性显著高于早晨,主要表现在夜晚的运动距离显著高于白天(P<0.05)。另外我们基于游泳速度将斑马鱼的运动划分为大运动、中运动、小运动和静止四种类型,WT斑马鱼在早上大运动比例明显较高,而在晚上的中、小运动占比最高;zko3145A突变体的大运动比例无论白天黑夜始终保持在低水平,在早上的小运动比例偏高,在晚上的中度运动较多。我们的数据证实了PRKCA在调节动物社会互动方面的作用,并将社会行为缺陷与紊乱的昼夜节律联系起来,为了解Prkcaa的功能所依据的分子机制提供了新的见解。