背景:结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是威胁人类健康最严重的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率位居所有癌症第三位。结直肠癌伴有远处转移(大多数为肝转移)患者的中位生存期只有约24-30个月,药物治疗效果不佳,亟需找到新的药物靶点开发药物。已发现有多种因子可以通过多种途径参与结直肠癌肝转移,但其发生机制仍然不明确,亟需进一步的深入研究。肿瘤微环境对肿瘤发展的影响日益引人注目。肿瘤微环境是一个动态的网络,它由多种类型的细胞(如肿瘤细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞等)以及细胞外成分(如细胞因子、生长因子和细胞外基质等)组成。前胶原-赖氨,2-酮戊二酸5-双加氧酶3(procollagen-lysine,2-oxoglutarate 5-dioxygenases 3,PLOD3)作为PLOD家族的一员,编码赖氨酸羟化酶LH3,其主要功能是通过催化前胶原分子翻译后的赖氨酸残基羟化促进胶原的成熟和分泌,进而维持细胞外基质稳定。PLOD家族蛋白表达主要受低氧诱导因子-1α、转化生长因子-β1等因子调控,不仅参与胶原成熟和细胞外基质重塑,还能诱导上皮-间质转化,在肿瘤发生发展中发挥重要作用。本研究旨在观察PLOD3在结直肠癌进展中的作用,并探讨其参与的分子机制。方法:1、生物信息学分析:使用TCGA(The Cancer Genome Atlas)、GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)、The Human Protein Atlas(HPA,http://www.proteinatlas.org/)、the Human Cancer Metastasis Database(HCMDB;http://hcmdb.i-sanger.com/index)等数据库,分析PLOD3与结直肠癌的相关性及预后的关系。2、临床标本分析:收集结直肠癌病理标本,使用免疫组化和western blot技术,探索结直肠癌与癌旁组织标本中,PLOD3表达的差异。3、构建PLOD3 sh RNA及过表达慢病毒,感染结肠癌细胞,构建敲低和过表达细胞模型,q PCR和western blot验证其表达情况;4、细胞功能实验:进行CCK8、克隆形成、划痕实验、transwell实验,检测PLOD3对细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响;5、使用PLOD3 sh RNA敲低细胞模型和对照细胞,进行RNA测序(RNA sequencing,RNAseq),寻找下游靶基因和信号通路;6、在敲低和过表达细胞模型中,检测β-catenin、c-myc、性别决定区相关转录因子4(Sexdetermining region Y-related high-mobility group box 4,SOX4)等关键分子的表达,使用免疫荧光检测PLOD3和β-catenin在细胞内的定位、定量及关系。7、在敲低和过表达细胞模型中,回复SOX4,进行CCK8、克隆形成、划痕实验、transwell实验,检测SOX4对PLOD3改变的回复能力;8、动物实验:将PLOD3敲低或过表达处理后的结肠癌细胞,进行裸鼠脾下成瘤和裸鼠脾脏注射肝转移实验,检测PLOD3肿瘤生长及转移的影响。结果:1、TCGA、HPA和GEPIA数据库提示:PLOD3在结直肠癌肿瘤组织中高表达。HCMDB数据库提示:高表达的PLOD3与Docetaxel作用结直肠癌肝转移相关。Kaplan-Meier分析提示高表达PLOMediator of paramutation1 (MOP1)D3与预后不良相关。2、在临床标本中,免疫组化和western blot实验提示PLOD3在结直肠癌中高表达。3、成功构建PLOD3稳定敲低(HCT116-P3-Sh)和过表达的细胞株(RKO-P3-OE)。4、细胞功能实验:PLOD3敲低明显降低结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。PLOD3Belumosudil过表达明显提高结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。5、RNAseq结果提示:敲低PLOD3后,影响关键基因SOX4和关键信号通路Wnt/β-catenin的表达;6、敲低PLOD3后,β-catenin、c-myc、SOX4等关键分子的表达明显下调,β-catenin在细胞浆与细胞核内的数量均减少。过表达PLOD3后,β-catenin、c-myc、SOX4等关键分子的表达明显上调,β-catenin在细胞浆与细胞核内的数量均升高。7、在PLOD3敲低细胞模型中,过表达SOX4,能一定程度回复敲低PLOD3对细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。在PLOD3过表达细胞模型中,敲低SOX4,能一定程度回复过表达PLOD3对细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。8、动物实验:敲低PLOD3能抑制结直肠癌的生长并抑制结直肠癌肝转移。过表达PLOD3能促进结直肠癌的生长。结论:PLOD3能通过激活结直肠癌细胞中的SOX4/Wnt/β-catenin信号轴增强肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力,促进肿瘤进展。PLOD3有望成为结直肠癌治疗的靶点和判断不良预后的指标。