背景和目的随着人口老龄化,癌症负担持续增长,癌症也成为最常见的死因。且随着人民生活方式的改变,消化系统肿瘤已成为重要的公共卫生问题,其中,结肠癌的发病率是胃肠道肿瘤中的第三名。肿瘤微环境中癌细胞的代谢重编程通常响应增加的营养、翻译和增殖需求而发生,以最大限度地提高它们对不断变化的环境的适应性。癌细胞在糖和氧气存在下表现出很高的糖酵解率以促进增殖,但在糖有限制的情况下,糖异生中第一个限速酶的线粒体型磷酸烯醇式丙酮酸激酶2(Phosphoenolpyruvate carboxykinase,mitochondrial,PCK2)可调节癌细胞的营养代谢方式,从谷氨酰胺提供碳源,维持癌细胞的能量来源;研究表明脂肪和肌肉组织中存在三种重要的脂质信号通路(丙酮酸代谢、胰岛素信号通路和脂肪细胞因子信号通路),这些途径中的关键常见差异表达基因(DEG)包括磷酸烯醇丙酮酸羧激酶2(PCK2),乙酰辅酶A羧化酶ACC以及丝裂原活化蛋白激酶(AMPK)基因家族。乙酰辅酶A羧化酶(ACC)催化乙酰辅酶A的羧化形成丙二酰辅酶A,其在哺乳动物中,存在两种具有不同生理功能的同工酶:胞质型ACC1参与新生脂肪生成(DNL),线粒体型ACC2参与线粒体β氧化的负调节,然而,PCK2是否影响人体内参与脂质信号通路尚不清楚。为研究谷氨酰胺饥饿处理后有哪些分子机制或者信号通路参与到应激后的代谢重编程调控,本课题组前期在人肝癌细胞系Hep G2中进行谷氨酰胺缺失处理48 h,随后进行RNA-seq测序,通过对测序结果进行差异基因筛选,筛选出在谷氨酰胺缺失处理后m RNA表达明显上调的8个基因:STC2、CHAC1、ASNS、TRIB3、DDIT3、PCK2Rapamycin配制、OSGIN1、GDF15,本研究选择PCK2作为研究对象,前期研究表明PCK2在谷氨酰胺缺失条件下表达升高,且参与肿瘤细胞代谢重编程,但是否影响肿瘤细胞增殖尚不清楚,PCK2参与代谢后如何发挥作用尚待研究。综上,本研究重点探讨PCK2在谷氨酰胺缺失条件下表达升高及其对细胞的增殖、代谢产生影响的相关分子机制,为未来癌证的预防、诊断及治疗提供新的理论依据和治疗靶点。方法1.选择HCT116和HepG2细胞株作为细胞模型,采用含有谷氨酰胺和不含谷氨酰胺的DMEM培养基培养细胞0 h、24 h、48 h,通过蛋白免疫印迹(Western blot)和实时荧光定量PCR(q PCR)实验检测PCK2蛋白和m RNA表达水平的变化情况。2.选择239 T细胞作为包装慢病毒的工具细胞,采用慢病毒包装针对PCK2的sh RNA,并感染HCT116和Hep G2细胞,筛选稳定敲低PCK2细胞株。3.构建PCDH-PCK2过表达质粒,通过慢病毒包装并感染HCT116和Hep G2细胞,筛选稳定过表达细胞株,联合谷氨酰胺缺失模型,通过细胞单克隆、CCK-8的增殖及Ed U实验,检测PCK2对细胞增殖的影响;另构建3x Flag-PCDH-PCK2载体,用于外源性IP实验。4.HCT116细胞敲低PCK2检测细胞周期相关蛋白的表达水平。5.HCT116细胞中敲低PCK2,通过Western blot检测糖酵解、三羧酸循环、脂质合成过程关键蛋白表达水平。6.采用RNA Immunoprecipitation(RIP)实验检测PCK2蛋白与p53的m RNA是否结合。7.Hep G2细胞中敲低PCK2,加入转录抑制剂放线菌素D(Actinomycin D),分别收取0 min、15 min、30 min、45 min、60 min的细胞,通过q PCR检测P53的m RNA表达水平。8.在稳定敲低PCK2的HCT116和Hep G2细胞中,采用中性脂肪酸的尼罗红(Nile red)染色检测脂质沉积情况,以探讨敲低PCK2后,影响脂质沉积的分子机制。结果1.HCT116和Hep G2细胞在谷氨酰胺缺失条件下分别培养0 h、24 h、48 h之后,Western blot和q PCR结果表明PCK2的蛋白水平及m RNA水平均随缺失时间延长呈升高趋势;2.在HCT116和Hep G2细胞中稳定敲低PCK2,通过细胞单克隆、CCK-8增殖及Ed U标记实验表明,敲低PCK2可显著抑制细胞增殖,且谷氨酰胺缺失后仍显示抑制增殖;过表达PCK2可促进细胞增殖;3.在HCT116细胞敲低PCKBiomolecules2,结果表明周期蛋白Cyclin E1和Cyclin B1表达水平明显降低;4.敲低PCK2后,糖酵解、三羧酸循环相关蛋白表达没有明显变化,脂质合成酶ACC1蛋白水平明显升高;PCK2过表达后ACC1蛋白水平明显降低;5.HCT116和Hep G2中敲低PCK2,尼罗红染色实验表明脂质沉积明显增加,过表达PCK2,脂质沉积明显减少。结论:1.PCK2定位在线粒体,响应谷氨酰胺缺失表达上调。2.PCK2通过促进细胞周期进而促进细胞增殖。3.PCK2可能结合p53 m RNA,从而影响AMPK进而CL13900配制抑制ACC1的表达。