PI3K抑制剂

研究植物次生代谢产物对害螨的作用机制是开发新型植物源杀螨剂的重要策略。滨蒿内酯是一种简单的天然香豆素类衍生物,可从中草药茵陈蒿(Artemisia capillaris Thunb.)中分离提取获得,对害螨具有高效的杀螨活性,但其作用机制和靶点仍不清楚。本论文旨在系统地探索滨蒿内酯对朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)杀螨的潜在分子靶点,并为指导未来将滨蒿内酯用作全球农业害螨的杀螨药剂提供基础支撑。本文利用RNA-Seq、RNAi技术、荧光标记[Ca~(2+)]_i浓度测定技术、原核表达技术、真核表达技术、GST pull-down技术和电压钳技术等实验技术,全面而系统地对滨蒿内酯的杀螨机制和和潜在分子靶点进行探讨;以新颖靶点Ca~(2+)信号通路为切入点,从分子靶标筛选、功能基因分析和活性靶点验证三个层次系统揭示了滨蒿内酯杀螨活性的毒理学分子机制,明确了滨蒿内酯杀螨的作用机理和分子靶标,揭示天然产物滨蒿内酯杀螨活性的新颖靶标位点,主要结果如下:1滨蒿内酯对朱砂叶螨杀螨活性相关的候选靶基因的筛选及鉴定荧光标记[Ca~(2+)]_i浓度测定表明,滨蒿内酯以剂量依赖性方式显著增加昆虫Sf9(Spodoptera frugiperda,草地贪夜蛾)细胞中的[Ca~(2+)]_i水平。其次,滨蒿内酯胁迫下朱砂叶螨的RNA-Seq数据分析表明:在滨蒿内酯和溶剂处理害螨48 h后,251个基因被确定为显著差异表达基因,其中192个基因上调,59个基因下调;使用GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库对差异基因进行功能富集分析表明,在GO和KEGG分析的前10个富集条目中,最富集的条目分别是“VGCC复合物”和“钙信号通路”。这些结果表明,朱砂叶螨体内的Ca~(2+)信号通路基因被滨蒿内酯过度激活。PPI(Protein-Protein Interaction)互作网络分析显示,钙调蛋白(Ca M1)是L-、T-和N-VGCC的主要相关信号分子;q PCR和RT-PCR分析表明,VGCCs和Ca Ms介导的钙信号通路的基因表达被不同浓度滨蒿内酯(LC_(70)、LC_(50)和LC_(30))激活;与其他Ca~(2+)信号通路基因相比,滨蒿内酯对L-VGCC和Ca M1基因表达的上调更为显著。最终,确定了1条L型-电压门控Ca~(2+)通道(VGCC)(Tc L-VGCC)、1条T型VGCC(Tc T-VGCC)、1条N型VGCC(Tc N-VGCC)和5条钙调蛋白(Ca M)(Tc Ca M1-5)介导的“钙信号通路”基因作为滨蒿内酯对朱砂叶螨杀螨活性相关的候选靶基因进行下一步研究。2朱砂叶螨Ca~(2+)通道(Tc L-VGCC、Tc N-VGCC、Tc T-VGCC)和钙调蛋白(Tc Ca M1-5)基因的生物学功能2.1朱砂叶螨3条钙离子通道基因(Tc L-、Tc T-、Tc N-VGCC)和5条钙调蛋白基因(Tc Ca M1-5)的克隆及序列分析序列比对分析结果表明,3条钙离子通道基因(Tc L-、Tc T-、Tc N-VGCC)都有获悉更多四个功能区(结构域I-IV),每个功能区由6个跨膜α-螺旋片段(S1-S6)组成;Tc Ca M1和Tc Ca M5分别包含4个和2个EF-hand结构域,Tc Ca M3包含1个跨膜α-螺旋,Tc Ca M2和Tc Ca M4不具有任何功能结构域;进化树分析表明,Tc L-、Tc T-、Tc N-VGCC与相应的昆虫纲、蛛形纲亲缘关系近,Tc Ca M1和Tc Ca M5与相应的蛛形纲亲缘关系近,Tc Ca M2、Tc Ca M3和Tc Ca M4与相应的昆虫纲亲缘关系近,而都与哺乳动物亲缘关系远;q PCR和RT-PCR分析表明,Tc L-、Tc T-、Tc N-VGCC和Tc Ca M1-5基因在朱砂叶螨所有发育阶段(卵,幼螨,若螨和成螨)都有表达。2.2朱砂叶螨Ca~(2+)通道(Tc L-、N-、T-VGCC)和钙调蛋白(Tc Ca M1-5)基因的RNAi研究q PCR和RT-PCR分析表明,与对照组相比,单独沉默Tc L-、Tc T-、Tc N-VGCC和Tc Ca M1-5基因的RNAi效率为50-72%;此外,L-VGCC和Ca M1的同时RNAi效率分别为68%和60%;生物测定结果表明,分别沉默Tc L-VGCC和Tc Ca M1基因的螨的死亡率显著低于对照组(分别为7.27倍和5.51倍),且同时沉默L-VGCC和Ca M1基因对螨虫死亡率的影响最大(11.48倍),表明Ca M1-和L-VGCC-介导的Ca~(2+)信号通路基因在滨蒿内酯的杀螨机制中扮演着最重要的角色。3滨蒿内酯激活朱砂叶螨Ca M1和L-VGCC基因介导的Ca~(2+)信号通路的分子机制钙调蛋白(Ca M)活性检测表明,滨蒿内酯在体外可以间接激活原核表达的Ca M1重组蛋白,其EC_(50)值为4.92μM;细胞内[Ca~(2+)]_i浓度分析表明,滨蒿内酯处理过表达Ca M1的Sf9细胞中的[Ca~(2+)]_i显著高于GFP表达细胞中的[Ca~(2+)]_i,证实了滨蒿内酯激活了Ca M1介导的螨体内Ca~(2+)信号通路。电生理分析表明,在没有Ca M1的情况下,滨蒿内酯显著增加了仅表达L-VGCC的卵母细胞中的电流,EC_(50)值为5.54μM;与Ca M1不同,在高浓度(>10μM)作用下,单独使用滨蒿内酯不会阻断Ca~(2+)通道活性;Ca M1增强了滨蒿内酯对L-VGCC钙通道的激活作用;滨蒿内酯显著增强Csingle-molecule biophysicsa M1介导的Ca~(2+)依赖性促进(CDF)和阻断Ca M1介导的Ca~(2+)依赖性失活(CDI)。4滨蒿内酯对朱砂叶螨Ca M1和L-VGCC介导的Ca~(2+)信号通路的靶标定位4.1朱砂叶螨钙调蛋白(Ca M1)对L-型Ca~(2+)通道(L-VGCC)的调控机制GST pull-down分析表明,钙调蛋白(Ca M1)可以与L-VGCC的N-末端(NT)和C-末端(CT)的近端CT1基序(CT1(包括EF-hand、Pre IQ和IQ基序)、CT1B(包括Pre IQ和IQ基序)、Pre IQ和IQ结合且呈浓度依赖性;在1 m M Ca~(2+)浓度条件下,多个Ca M1分子可与L-VGCC的C-末端(CT)的CT1B或CT1结合;Ca M与Ca~(2+)通道的N-末端(NT)结合需要较高的[Ca~(2+)]_i;在1 m M Ca~(2+)浓度条件下,对Ca M1与GST融合蛋白亲和力的大小进行排序,顺序如下:CT1B>CT1≈IQ>Pre IQ>NT;在100 n M Ca~(2+)浓度条件下,对Ca M1与GST融合蛋白亲和力的大小进行排序,顺序如下:Pre IQ>NT>CT1B>CT1>IQ。4.2滨蒿内酯对朱砂叶螨Ca M1和L-VGCC介导的Ca~(2+)信号通路的靶向调控位点GST pGefitinib-based PROTAC 3ull-down分析表明,滨蒿内酯显著促进了钙调蛋白(Ca M1)与L型-Ca~(2+)通道(L-VGCC)的C-末端的IQ结构域的结合;L型-Ca~(2+)通道(L-VGCC)中的IQ结构域(Ca M1结合的保守基序)突变为AA基序,显著降低其与Ca M1的结合能力(下降了66.78%)。电生理实验表明,野生型Ca~(2+)通道(L-VGCC)(WT-IQ)显示出显著的Ca~(2+)依赖性失活(CDI);与WT-IQ通道相比,突变型L-VGCC(MT-AA)通道的CDI值比其高了2.72倍,而MT-AA通道的CDF值比其低了1.51倍,结果表明,L-VGCC的IQ基序突变促进了Ca~(2+)通道的CDI并阻断了Ca~(2+)通道的CDF;在表达突变型Ca~(2+)通道(MT-AA)并用滨蒿内酯(EC_(50),5.54μM)预处理的卵母细胞中,表现显著的Ca~(2+)依赖性失活(CDI),结果表明,滨蒿内酯通过增强Ca M1-IQ相互作用从而阻断Ca M介导的L-VGCC的CDI或促进CDF。5滨蒿内酯对朱砂叶螨杀螨作用的新靶点功能根据目前的研究结果,得出滨蒿内酯对朱砂叶螨Ca M1和L-VGCC介导的Ca~(2+)信号通路的靶向调控位点的模型:在低[Ca~(2+)]_i下,Ca M主要以无Ca~(2+)形式(apo Ca M)存在,并以相对较高的亲和力与Pre IQ(Ca~(2+)通道的CT基序)相互作用,产生基础通道活性。由于apo Ca M对IQ/NT区域的亲和力相对较低,它们之间的相互作用可能很小。然而,当[Ca~(2+)]_i增加时,Ca~(2+)与Ca M结合,形成Ca~(2+)/Ca M,其与IQ基序具有较高的亲和力,从而触发促进Ca~(2+)依赖性促进(CDF)。滨蒿内酯作为激动剂在该位点诱导IQ/Ca M结合,然后以浓度依赖性方式诱导Ca~(2+)通道活性。综上所述,本研究表明,滨蒿内酯的作用方式涉及靶向Ca M1和L-VGCC之间的界面以及调节下游Ca~(2+)信号通路。有趣的是,Ca M1增强了滨蒿内酯的通道激活作用。滨蒿内酯激活Ca M结合位点,该位点位于Ca~(2+)通道C-末端的IQ基序中。因此,IQ基序可能是一种有前途的新型“绿色杀螨剂”结合的新靶标位点。它的鉴定可能会加速新型杀螨剂的开发,以控制全球范围内的破坏性植食性害螨。此外,本研究的结果可能有助于开发基于L-VGCC的靶标特异性绿色杀螨化合物。

目的 总结乳腺癌改良根治术后胸壁复发结节的超声图像特征，并构建预测模型，探讨其应用价值。方法 选取我院102例乳腺癌改良根治术后胸壁结节患者，其中恶性结节57例（复发组），良性结节45例（良性组），比较两组超声图像特征；应用多因素Logistic回归分析筛选乳腺癌术后Stem Cell Culture胸壁结节恶性风险预测因素，并建立预测模型，分析其预测胸壁结节恶性风险的诊断效能。结果 两组结节最大径、数Bucladesine目、累及组织层次、边界、形态、钙化、周围组织回声变化、血流分级和间隔时间比较差异均有统计学意义（均P<0.05）。多因素Logistic回归分析显示，胸壁结节最大径、数目、边界、血流分级、间隔时间是乳腺癌术后胸壁结节恶性风险的独立影响因素（均P<0.05）。建立预测模型为：Logit(P)=-5.126+0.086X1+2.315X2+2.549X3+1.8获悉更多74X4+1.945X5(X1：病灶最大径，X2：病灶数目，X3：边界，X4：血流分级，X5：间隔时间)，其预测胸壁结节恶性风险的灵敏度、特异度、准确率、曲线下面积及95%可信区间分别为91.2%、82.2%、87.3%、0.935(0.890～0.979)。结论 基于超声图像特征构建的预测模型能有效评估乳腺癌改良根治术后胸壁结节恶性风险。

目的 建立有错配的加尾双引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应(T-Afunctional biologyRMS PCR)多重检测的方法，实现针对肝细胞癌常见基因突变位点TP53 R249S、TP53 R273H、CTNNB1 S45F的多重检测。方法 针对3个基因突变位点进行引物设计，每个基因突变位点所设计引物序列的5′端不加一段DNA序列(Tail Free Primer)或者所设计的引物序列5′端加一段相同的DNA序列(Tailed Primer),利用实时荧光定量PCR仪分别检测并比较3个基因突变位点的不同引物序列形成的单重体系、三重体系的扩增结果，研究T-AMRS PCR方法对突变型基因位点突变负荷的检测限、特异性和多靶标检测能力。结果 3个基因突变位点Tailed Primer单重体系扩增结果显示，突变型质粒的扩Telaglenastat临床试验增均优于野生型质粒，野生型质粒的扩增均被有效抑制，突变负荷检测限低至0.10%,特异性良好。Tailed Primer三重体系减少了引物二聚体的产生，调控CTNNB1 S45F、TP53 R249S、TP53 R273H的解链温度分别为81.11℃、82.36℃、86.35℃,实现不同突变位点的显著区分。与Taqman探针基因分型方法相比，T-AMRS PCR方法野生型和突变型基因的Ct值差异更显著，单荧光通道即可实现突变基因检测。结论 运用T-ARMS PCR进行一管三重检测，分析熔解曲线，能有效检测到目的基因突变，抑制野生型模板的扩增，并区分不同的基因突变位点；同时，Tailed Primer设计减少了多重情况下引物二聚体的产生。该方法可为临床中肝细胞癌的早期筛查、预后预测、病情监测提供理论依FG-4592细胞培养据。

目的 探讨自噬相关基因5(autophagy-reC59研究购买lated gene 5, ATG5)在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC进展中的作用及其影响的下游信号通路。方法 通过肿瘤基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）数据库查找ATG5在HCC患者的组织表达及其亚组的差异分析。采用免疫印迹法明确ATG5在HCC细胞系中的表达水平。通过CCK-8实验、划痕实验和Transwell实验观察敲减ATG5基因后对HCC细胞系（HCCLM3和MHCC97-H）增殖、迁移和侵袭功能的变化。在HCC细胞系MHCC97-H敲减ATG5基因后，使用有参转录组测序分析下游相关信号通路的变化。结果 TCGA数据库分析显示，在m RNA水平，ATG5在HCC组织的表达明显高于正常肝组织（P<0.000 1）,HCC 3期患者的ATG5水平高于1期患者的水平（P=0.013）,p53变异组患者癌组织的ATG5水平高于非变异组（P<0.000 1）。免疫印迹结果显示，与正常肝细胞L02相Insulin biosimilars比，ATG5蛋白水平在检测的HCC细胞株中均明显高表达。将ATG5基因敲减后发现，HCC细胞的增殖、迁移、侵袭的能力下降，有参测序发现其明显影响p53信号通路的基因表达，富集分析发现与细胞周期有关，同时影响了自噬相关基因的差异表达。结论 ATG5下调可抑制HTamoxifen供应商CC细胞的增殖、迁移和侵袭，同时可通过影响p53信号通路促进HCC发展。

目的 探讨纤维乳腺导管内视镜(FDS)在病理性乳头溢液(PND)诊治中的应用价值。方法 选取2011年1月至2020年1月该院乳腺外科收治的单侧单孔PND患者共126例进Navitoclax半抑制浓度行回顾性研究。将90例经术前FDS二维定位联合术中美蓝染色跟踪定位下行区段切除术的患者纳入观察组。将36例未行FDSGW4869 IC50检查，在传统美蓝染色跟踪定位下行区段切除术的患者纳入对照组。两组均进行病理检查。术中视组织缺损情况，行乳头乳晕复合体(NAC)或(和)转移带蒂复合组织瓣成形术。比较两组的病理结果阳性率、术后外观满意度、区段切除术手术时间、治疗费用及并发症情况。结果 观察组病理结果阳性率为95.6%,显著高于对照组的80.6%,差异有统计学意义(Pbone biomarkers<0.05)。观察组区段切除术手术时间低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。除浸润性乳腺癌和乳腺导管原位癌患者外，观察组患者治疗费用与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。观察组并发症发生率低于对照组，术后外观满意度高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 区段切除术前采用FDS二维定位联合术中美蓝染色跟踪法，可提高患者术后外观满意度、病理结果阳性率，同时减少术后并发症和缩短手术时间，且不增加治疗费用。

[目的]研究老年乳腺癌患者化疗期间消化道反应的危险因素，以期为临床诊治提供参考。[方法]回顾性分析经病理确诊且采用联合化疗及支持治疗的190例老年乳腺癌患者的临床资料。采用安德森症状评估量表中文版(MDASI-C)进行调查，按照消化道反应分为Genetic selection无或轻度患者155例(对照组),中度或重度患者35例(研究组)。应用单因素分析老年乳腺癌患者化疗期间消化道反应的影响因素，并采用多因素Logistic分析对上述有差异的统计学资料进行进一步回归分析，最终探讨影响其独立危险因素。[结果]190例患者发生中重度消化道反应35例，发生率18.42%。单因素分析显示，职业状态、文化程度、病程、疾病分期、化疗方案、化疗次数、心理一致感是老年乳腺癌患者化疗期间消化道反应的危险因素，差异有统计学意义(P<0.05)。多因素分析显示，病程、化疗次数、心理一致感均为老年乳腺癌患者化疗期间selleck合成消化道反应的独立危险因素，差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]老年乳腺癌化疗期间消化道反应的危险因素较多，而其病程、化疗次数、心理一致感等Erastin细胞培养是高危因素，临床上针对此类患者应加强重点监测。

目的 观察左归丸对乳腺癌细胞侵袭、迁移的影响，探讨其作用机制是否与其调节巨噬细胞移动抑制因子表达有关。方法 以人乳腺癌细胞MDA-MB-231为研究对象，制备左归丸含药血清，实验分为空白对照组、左归丸低、中、高剂量(4.84,9.68,19.36 g·kg~(-1))组、西黄丸(0.55 g·kg~(-1))组。孵育24 h、48 h、72 h,采用噻唑蓝(MTT)法检测左归丸LY2157299生产商含药血清对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响；采用Transwell小室检测左归丸含药血清对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响；采用细胞划痕实验检测左归丸含药血清对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移能力的影响；采用Hoechst33342染色法观察凋亡细胞核的变化；采用ELISA法检测左归丸含药血清对乳腺癌MDA-MB-JNJ-42756493231细胞上清液IL-8含量的影响；采用Western blot法检测左归丸含药血清对乳腺癌MDA-MB-231细胞巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。结果 左归丸含药血清能够抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、侵袭、迁移，促进细胞凋亡，减少IL-8含量，抑制MIF、VEGF表达。结论 左归丸含药血清能够有效抑制乳腺癌MDA-MB-231bone biopsy细胞的增殖、侵袭和迁移，可能与其调节MIF、VEGF表达有关。

目的:探讨增强型体外反搏治疗(EECP)对冠心病(CHD)患者运动动能、心率恢复及预后的影响。方法:纳入在我院行EECP治疗的CHD患者142例，随机分为药物治疗组(72例)和EECP组(70例，EECP联合药物治疗),比较两组治疗前后通过心肺运动试验测得的最大运动负荷、代谢当量、运动时长及心率的变化，多因素Cox分析两组患者随访期间发生的主要不良心血SB203580配制管事件(MACE)的影响因Z-IETD-FMK浓度素。结果:与药物治疗组比较，EECP组患者治疗后的最大运动负荷[(98.75±31.16)W比(115.77±35.50)W]、代谢当量[(5.09±1.25)Mets比(5.84±1.47) Mets]、运动时长[(440.97±67.92)s比(509.23±96.65)s]均显著增加(P均<0.01);两组治疗后的静息心率、峰值心率、运动结束后恢复1、2min时的心率相比，差异均无统计学意义(P均>0.05)。多因素Cox分析显示，在排除其他影响core needle biopsy因素的情况下，EECP治疗可以减少CHD患者MACE的发生(HR=0.38,P=0.001);且NYHA分级≥3级(HR=2.1,P=0.028)、三支血管病变(HR=3.011,P=0.005)和糖尿病(HR=2.144,P=0.007)为CHD患者预后不良的独立危险因素。结论:增强型体外反搏联合药物治疗可以显著增强冠心病患者的运动功能，降低主要不良心血管事件风险，对运动后心率恢复影响不显著。

为给噬菌体防控禽大肠杆菌病提供参考和依据，以禽致病性大肠杆菌为宿主菌，利用双层琼脂平板法从鸡场粪便样品中分离纯化禽致病性大肠杆菌噬菌体，对其形态、裂解谱、最佳感染复数（MOI）、一步生长曲线、p H和温度稳定性、体外抑菌能力及抑制生物被膜形成能力进行测定，并通过全基因组测序分析其基因组特征。结果显示，分离到1株裂解性禽致病性大肠杆菌噬菌体v B＿EcoS＿AH50，透射电镜观察显示其属于有尾噬菌体目长尾噬菌体科。v B＿EcoS＿AH50可特异性裂解O1和O2血清型大肠杆菌；MOI为1；潜伏期和爆发期均为20 min，爆发量约为76 PFU/cell；在4～50℃和pH值在LY2835219体内3～11的范围内可保持较强的AY-22989细胞培养裂解能力，且在室温下能稳定存活4周。在MOI分别为0.01、0.1和1的条件下，该噬菌体能够有效抑制大肠杆菌生长及形成生物被膜。全基因组测序发现，v B＿EcoS＿AH50基因组全长为37 268 bp，不含有与毒力因子、毒素、耐药和溶源性相关基因。BLASTn比对显示，该噬菌体全基因组序列与噬菌体PC2最为相近，具有94.56%的一致性和94%的覆盖率。基于噬菌体末端酶大亚基构建的系统发育树显示，v B＿EcoS＿AH50与噬菌体v B＿EcoS＿011D5的亲缘关系最近。结果表明，噬菌体v B＿EcoS＿AH50可特异性裂解大肠杆菌，裂解能力强、耐受性高、安全性好，提CRISPR Knockout Kits示其在防治禽大肠杆菌病方面均有潜在应用价值。

目的 探讨抗生素应用时间对产妇剖宫产后切口感染及血清生化指标的影响。方法 选取300例剖宫产产妇为研究对象，根据随机数字表法分为观察组和对照组，2组均150例，观察组手术前30 min静脉滴注给予抗生素，对照组手术后静脉滴注给予抗生素，观察和比较2组产妇的手术时间、术中出血量、住院时间、住院费用、切口愈合等级、白细胞(WBC)计数、C-反应蛋白(CRP)、CH-223191作用降钙素原(PCT)和感染率。结果 观察组产妇的术中出血量、体温恢复时间、住院时间和住院费用均显著低(短)于对照组(P<0.0此网站5);观察组产妇切口愈合等级为甲级的数量显著高于对照组(P<0.05),切口愈合等级为乙级和丙级的数量显著低于对照组(P<0.05);2组产妇手术后的WBC、CRP和PCT水平均升高(P<0.05),且对照组产妇上述指标升高更显著(P<Biodiesel Cryptococcus laurentii0.05);观察组产妇的感染率为4.67%,显著低于对照组产妇的感染率(32.67%)(P<0.05)。结论 在剖宫产手术前预防性应用抗菌药物，能够降低产妇术后切口感染率，并有效缓解产妇机体的炎症反应，是临床预防产妇切口感染的有效方法。