PI3K抑制剂

目的 研究四川Medicare Part B马先蒿Pedicularis szetschuanica Maxim.的化学成分及其体外抗乳腺癌活性。方法 80%乙醇提取物采用多种色谱进行分离纯化，根据理化性质及波谱数据鉴定所得化合物的结构；采用MTT法测试各化合物对人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用。结果 从中分离得到12个化合物，分别鉴定为argyol (1)、artselaenins A (2)、PLX4032campsinol (3)、4-hydroxymethylboschnialactone (4)、8-epideoxy loganic acid (5)、山柰酚(6)、8-对羟苄基山柰酚(7)、槲皮素(8)、松脂素(9)、3-甲氧基-4-羟基苯乙醇(10)、腺嘌呤核苷(11)、2-羟甲基-5-羟基吡啶(12)。通过体外乳腺癌细胞增殖抑制活性分析，化合物3对MCF-7细胞的抑制作用较好，IC_(50)等于(46.5±2.7)μmol/L,化合物8对MDA-MB-231细胞的IC_(50)值为(14.8±1.1)μmol/L。结论 化合物1～6、8、11为首次从四川马先蒿中分离得到。其中化合物7、9、10、1获悉更多2为首次从马先蒿属植物中分离得到。化合物3对MCF-7抑制活性较弱，化合物8对MDA-MB-231抑制活性中等。

狂犬病是一种致死率几乎为100%的人兽共患病,狂犬病病毒在动物间循环传播且可感染人类,一旦出现临床症状将导致不可逆转的死亡。目前狂犬病的防控重点由保护易感人群转向动物间狂犬病的预防。准确的识别和诊断狂犬病是精准防控的基础,实验室诊断作为狂犬病确诊的”金标准”却未能大规模的实践和应用。为了进一步推广狂犬病实验室诊断相关技术及狂犬疫苗免疫后的效果评价,本次汇报阐明狂犬病疑似患者的样本采集和运输、生物安全管理及实验室检测技术,介绍其生前和死后等不同情况下采用的最佳检测策略,并重点讲述聚合酶direct to consumer genetic testing链式反应(RT-PCR)和直接免疫荧光法(D购买NVP-TNKS656FA)两种病原学相关检测的原理和研究进展,并进一步明确相关方法的应用场景,重点介绍狂犬疫苗免疫后的中和抗体评估手段,即使用快速荧光灶抑制试验(RFFIT)对中和抗体进行定量检测,从方法的原理设计、操作步骤和适用范围进行详细讲解。促进狂犬病相关知识的普及和健康教育,规范狂犬病实验室诊断程序、构建人和动物间的和谐氛围,是防控狂犬病的有效措施。提高狂犬病实验室诊断率和可靠性为2030年实现消除狂犬病提供确认细节可靠支持。

艾滋病、癌症和器官移植等造成免疫抑制人群的不断增加,侵袭性真菌感染发生的概率也随之显著增加,导致大量的患者死亡。据统计每年全球有超过一百万人死于侵袭性真菌感染。然而,抗真菌药物不仅种类少,而且存在耐药性、毒副作用多、抗菌谱窄等问题,导致部分侵袭性真菌感染的死亡率高于50%。因此寻找安全有效的新型抗真菌药物迫在眉睫。近年来,许多新的方法与思路被引入抗真菌药物的开发,药物发现方法从最初的随机活性筛选逐步扩展到针对某一特定化合物类型、特定药物靶点或生理途径的相对理想的活性筛选。本论文分别围绕抗菌模拟肽的活性筛选和靶向病原真菌特定途径两个角度出发寻找新型抗真菌活性物质和初步构建抗真菌活性物质筛选模型。具体研究内容为:(1)MW系列γ-AA模拟肽抗真菌活性筛选及机制研究背景:MW系列γ-AA模拟肽设计思路来自于宿主防御肽,它包含γ手性肽核酸骨架、带正电的头部和疏水的尾部,其中γ手性肽核酸骨架对蛋白质水解具有优良抗性,同时带正电氨基酸和疏水氨基酸对抗菌活性很重要。目的:对蔡健峰教授实验室合成的MW系列γ-AA模拟肽的抗真菌活性进行筛选,以期获得潜在的抗真菌剂,并研究其作用机制,为后续抗真菌γ-AA模拟肽的设计提供新思路。方法:1、通过测定MW系列γ-AA模拟肽对实验室保藏致病真菌与临床耐药菌的MIC_(50)和HC_(50),并利用时间-杀菌曲线实验筛选出MW系列中抗真菌活性最好的γ-AA模拟肽。2、使用DAPI/PI双染色法和扫描电镜测定MW5对细胞膜的完整性的影响,并采用DCFH-DA染色法测定MW5对细胞内活性氧的影响。再通过25天的耐药诱导folding intermediate判断MW5是否容易产生耐药性。3、联合使用MW5与临床一线用药氟康唑通过棋盘法对实验室保藏真菌进行测定,判断MW5是否具有与氟康唑联合用药的能力,并根据不同耐药菌株生长情况推断MW5的作用靶点;采用RT-q PCR测定MW5对唑类药物耐药外排泵Mdr1、Cdr1和Cdr2的转录水平,并通过荧光成像、荧光强度测定和流式细胞术观测外排泵荧光底物在细胞内的积累,以此推测MW5与氟康唑联合的作用机制。4、使用大蜡螟模型、小鼠系统感染模型和小鼠表皮感染模型测定MW5单独使用或与氟康唑联用时的体内药效。结果:1、通过对MW系列γ-AA模拟肽的抗菌谱进行测定,筛选出MW3和MW5的抗真菌活性更好,溶血活性和时间杀菌曲线实验证明MW5的杀菌活性强于MW3且溶血性也弱于MW3,MW5对酵母菌及丝状真菌都有很强的杀菌活性,对酵母菌的MIC_(50)都为2μg/m L,对致病丝状真菌烟曲霉的MIC_(50)为4μg/m L,对毛霉的MIC_(50)为4-8μg/m L,时间杀菌曲线表明在4×MIC_(50)的条件下MW5可以在45min内杀死隐球菌H99和白色念珠菌SC5314和CARG5。2、使用DAPI/PI双染色法发现MW5在杀菌浓度下会破坏细胞膜通透性且破坏能力随MW5浓度增加而增强,在扫描电镜下也观察到杀菌浓度的MW5会导致真菌表面出现折叠和损伤,采用DCFH-DA染色法观察到MW5会诱导真菌细胞内活性氧(ROS)的产生,诱导能力随MW5浓度增加而增强,且在添加抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)清除ROS后能够降低MW5的杀菌能力。在经过25天的耐药诱导后MW5对白色念珠菌SC5314的MIC_(50)没有改变,并且氟康唑在有MW5存在的条件下经过25天的耐药诱导后MIC_(50)值仅增加了2倍。3、在联合用药实验中发现MW5与氟康唑联用对外排泵Mdr1过表达的白色念珠菌耐药株有明显的协同作用,对其他大部分菌株为增效作用,因此推测MW5增强氟康唑效力的靶点为药物外排泵Mdr1;并且RT-q PCR发现MW5对主要药物外排泵Mdr1、Cdr1和Cdr2的基因表达无显著影响,荧光成像、荧光强度测定和流式细胞术观察到亚抑菌浓度的MW5使Mdr1底物尼罗红和荧光FLC-Bodipy在耐药细胞内积累增多。4、在体内药效实验中发现MW5在野生型白色念珠菌感染大蜡螟模型中与阳性药氟康唑有相似的治疗效果;在小鼠表皮感染耐药白色念珠菌菌模型中,单独使用MW5或氟康唑治疗无明显的治疗效果,而药物联用使表皮的菌载量降低了0.6个数量级。结论:MW5具有强力的杀真菌活性和较低的JQ1毒性,且不易产生耐药性;高浓度MW5通过破坏真菌细胞膜并诱导细胞产生ROS进而导致细胞死亡,低浓度MW5与氟康唑联用时通过破坏药物外排泵Mdr1使氟康唑在真菌细胞内有效浓度增加而增效,并且在体内药效模型中MW5也能有效治疗真菌感染。(2)靶向隐球菌Prp8内含肽药物筛选模型的初步构建背景:真菌蛋白的选择性剪接通常由内含肽(Intein)介导。在致病真菌新生隐球菌的m RNA剪接体核心蛋白Prp8中含有一个保守的内含肽序列。内含肽抑制剂导致内含肽不能被剪接时,功能性Prp8就无法形成,从而破坏隐球菌m RNA剪接过程和抑制隐球菌的生长繁殖。目的:本论文拟构建Prp8 intein的全细胞筛选模型,包括无内含肽敲除株和Prp8诱导表达菌株,用于今后的内含肽抑制剂的筛选。方法:1、使用CRISPR-Cas9方法构建Prp8条件表达株和Intein缺失株,并通过PCR验证目的片段大小、表型验证目的菌株的生长、RT-q PCR验证prp8表达和Western Blot验证Prp8蛋白表达等方法验证菌株构建是否成功。2、构建Intein表达重组质粒,使用Ni柱亲和层析纯化表达蛋白。3、通过转录组测序比较新生隐球菌在有无靶向Intein阳性药6G-318SVX-765浓度处理下的差异表达基因,并寻找特异的差异基因作为Biomarker。结果:1、本研究成功构建了启动子pCTR4诱导的Prp8条件表达株,PCR验证菌株构建成功,表型实验表明Cu~(2+)能够有效抑制P_(CTR4)-prp8菌株生长,RT-q PCR实验表明Cu~(2+)能够有效抑制prp8基因表达,Western Blot实验表明Cu~(2+)能够抑制Prp8蛋白表达,PCR和表型实验验证Intein缺失株构建成功;2、成功在大肠杆菌Rosetta(DE3)宿主中异源表达Intein,但未能获得纯蛋白。3、在转录组测序后推测表达量变化中最高的20个基因中与内含子含量变化相关的4个功能基因作为Biomarker。结论:本研究成功构建了诱导启动子pCTR4的诱导表达Prp8菌株,该菌株可以模拟Prp8的低表达状态,提高菌株对抑制剂响应的敏感性,还成功构建了Intein缺失株,该菌株对内含肽抑制剂的敏感性可能将降低,本论文的研究结果为进一步筛选靶向新生隐球菌Prp8内含肽的抑制剂奠定了坚实的基础。

该文探讨了miR-32-3p通过靶向Smad3调节氧糖剥夺/再灌注损伤中的细胞活力。通过利用SK-N-SH细胞构建了一个研究脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)的氧糖剥夺/再灌注(oxygen-glucose deprivation and reperfusion,OGD/R)模型。通过生物信息学预测miR-32-3p的靶基因并进行功能注释和筛选;通过双荧光素酶报告实验、实时定量PCR、Western blot、CCK-8和活/死细胞检测等实验检测miR-32-3p通过靶向Smad3对细胞活力Tezacaftor研究购买的影响。结果显示,Smad3是miR-32-3p的新靶点,并且在SK-N-SH OGD/R模型中miR-32-3p表达上调。CCK-8分析表明,与miR-32-3p抑制剂对照组和shNC组相比,sh-Smad3和miR-32-3p抑制剂+sh-Smad3组的细胞活力显著降低。随后,活/死细胞活力测定进一步支持了这些结果。与抑制剂NC和shNC组相比,sh-Smad3和miR-32-3p抑制剂+swww.selleck.cn/products/Everolimus(RAD001)h-Smad3组中可观察到更多以红色荧光表示的死亡细胞。与SK-N-SH细胞相比,OGD/R细胞的Lats2、Yap/Taz和Smad3水平降低。这些结果表明,缺乏Smad3可能会抑制细胞活力。这些结果说明,medication abortionHippo信号通路中的Smad3、Lats2和Yap/Taz可能共同调节细胞活力。

目的 探讨重组人血管内皮抑制素联合肝动脉化疗栓塞术(TACE)对晚期肝癌患者的治疗效果，以期延长患者生存期。方法 选取2020年1月-2021Empagliflozin研究购买年2月收治的晚期肝癌患者98例，根据数字表法分为对照组和联合组，各49例。对照组采用TACE术治疗，联合组采用重组人血管内皮抑制素联合TACE术治疗。比较两组疾病缓解率、治疗前后肿瘤直径、卡氏(KPS)评分、血清肿瘤标志物[甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、糖链抗原242(CA242)、糖链抗原724(CA724)]水平、血清血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、凝血酶敏感蛋白1(TSP-1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8(Caspase-8)水平、1年生存率。结果 两组客观缓解率比较，联合组(63.27%)高于对LY2157299照组(40.82%)(P<0.05);与对照组相比，治疗后联合组肿瘤直径较小，KPS评分较高(P<0.05);治疗后联合组血清AFP、CEA、CA242、CA724水平降低幅度大于对照组(P<0.05);与对照组相比，治疗后联合组血清VEGF、MMP-9水平明显降低，TSP-1、Caspase-8水平明显升高(P<0.05);联合组1年生存率为42.55%(20/47),高于对照组22.22%(10/45)(PImmunisation coverage<0.05)。结论 重组人血管内皮抑制素联合TACE术对于晚期肝癌效果显著，能促进血清相关肿瘤标志物水平改善，抑制肿瘤进展，提高生存质量，延长生存期。

为系统阐明金抗肽SIF_(4)对大肠杆菌呼吸代谢和能量代谢的抑制机理，研究了SIF_(4)对菌体新陈代谢活力、呼吸代谢途径、细胞质膜离子通道ATP酶及胞内ATP生物合成的影响。研究发现，随着SIF_(4)处理剂量增加，菌体代谢活力显著降低（P<0.05），2MIC组菌体代谢活力相比对照组降低了70.41%；呼吸抑制率结果表明，SIF_(4)对菌体呼吸有较好抑制活性，MIC组和2MIC组呼吸抑制率分别为（19.39±0.17）%和（25.22± 0.Molecular Biology Software32）%；呼吸叠加率结果表明，金抗肽与碘乙酸呼吸叠加率最低（19.98±0.13）%，由此可推断，SIF_(4)主要通过抑制糖酵解途径实现高抗菌活性；SIF_(4)处理后，细胞质膜离子通道Na~(+)K~(+)-ATP和Ca~(2+)Mg~(2+)-ATP酶活性均有不同程度下降，且降幅与处理剂量和时间呈正Taurine价格相关关系，但均弱于阳性对照组（TritonX-100组）；随着S点击此处IF_(4)处理时间和处理剂量增加，胞内ATP含量显著降低，处理12h时，2MIC组胞内ATP含量降幅达到65.62%，显著低于阳性对照组（P<0.05）。结果表明：金抗肽SIF_(4)可通过影响菌体呼吸代谢、削弱细胞质膜离子通道ATP酶活性和抑制胞内ATP合成实现对大肠杆菌的高效抑菌活性，研究结果可为金抗肽SIF_(4)对食源性大肠杆菌生物防控提供理论支持。

目的：观察黄蜀葵花总黄酮（total flavone of Abelmoschus manihot,TFA）对肠道成纤维细胞合成Ⅰ型胶原蛋白（Collagen Ⅰ）的影响，探讨TFA治疗克罗恩病肠道纤维化的机制。方法：从SD大鼠中分离原代肠道成纤维细胞（intestinal fibroblasts,IFs），使用免疫荧光法鉴定细胞特征。利用胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)构建IFs细胞模型，随机分为对照组、模型组和TFA低、中、高剂量（5、10、50μg/mL）组。CCK-8法检测TFA及雷帕霉素（rapamycin,RAPA）对IFs细selleckchem胞最佳干预条件。通过免疫荧光法检测LC3Ⅱ、Beclin-1、ATG16L1及p62等自噬有关蛋白表达，使用mRFP-GFP-LC3实验检测自噬流水平。采用Western blot和qRT-PCR法测定Collagen Ⅰ水平。用AMPK抑制剂化合物C(Compound C,CC)、mTOR抑制剂RAPA联合TFA处理IGF-1刺激的IFs细胞，将细胞随机分为对照组、模型组、TFA(10μg/mL)组、TFA+CC组、TFA+RAPA组。采用免疫荧光及mRFP-GFP-LC3实验检测自噬水平。运用Western blot和qRT-PCR法评估Collagen Ⅰ水平。采用Western blot法检测p-AMPK、p-MTOR、p-p70S6K和p-4EBP1蛋白表达。结果：免疫荧光结果显示，原代细胞具有Vimentin(+),α-SMA（-）的特征，证明其为肠道成纤维细胞。CCK-8结果提示，TFA最佳干预浓度为5、10、50μg/mL，时间为48 h;RAPA最佳干预浓度为5 nmol/mL，时间为48 h。与对照组相比，模型组的Collagen Ⅰ蛋白及mRNA水平上升（P <0.01），自噬有关蛋白LC3Ⅱ、Beclin-1、ATG16L1等表达减弱，p62表达上升，自噬流减少，p-AMPK/AMPK比值降低，p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K和p-4EBP1/4EBP1比值升高（P <0.01）。与模型组相比，TFA各剂量组Collagen Ⅰ水平降低（selleckchem VP-16P <0.01），自噬水平上升，其中高剂量组最明显；TFA(10μg/mL)组p-AMPK/AMPK比值上调，p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K和p-4EBP1/4EBP1比值下调（P <0.01）。与TFA组相比，TFA+CC组中CollagenⅠ水平升高（P <0.01），自噬水平下降，p-AMPK/AMPK比值下降，p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K和p-4EBP1/4EBMedical billingP1比值上升（P <0.01）;TFA+RAPA组中CollagenⅠ水平降低（P <0.01），自噬水平上升，p-AMPK/AMPK比值增加，p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K和p-4EBP1/4EBP1比值降低（P <0.01）。结论：TFA可以通过激活AMPK/mTOR通路调节细胞自噬以抑制Ⅰ型胶原蛋白生成，改善肠道纤维化。

为探究转化生长因子β激活激酶1基因(TAK1)在硬骨鱼先天免疫中的重要作用，本研究基于实验室已建的牙鲆(Paralichthys olivaceus)转录组数据库，对牙鲆TAK1基因(PoTAK1)进行了克隆及验证。研究显示，其开放阅读框(ORF)长为1 728 bp,编码575个氨基点击此处酸，蛋白分子量(Mw)约为64Biotin cadaverine.33 kDa,理论等电点(pI)为6.66,编码的蛋白在N端具有一个S＿TKc结构域，在C端具有一个卷曲螺旋区域(Coiled coil region)。氨基酸多序列比对和系统发育分析表明，TAK1基因在脊椎动物中高度保守。组织表达分析显示，PoTAK1在肝脏和鳃中的表达量较高；体内攻毒实验表明，被迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染后，PoTAK1在脾脏和头肾中的表达量均显著上调；体外免疫刺激实验表明，Poly I:C、TNF-α和迟缓爱德华氏菌刺激后，在各时间点牙鲆鳃细胞系中PoTAK1Pidnarulex浓度的表达量均显著上调。亚细胞定位显示，PoTAK1主要在细胞质中表达。双萤光素酶报告实验证明，PoTAK1能够激活MAPK通路下游AP-1转录因子的活性。体外免疫调节检测实验表明，过表达PoTAK1能够上调AP-1下游IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等促炎细胞因子的转录表达。研究结果表明，PoTAK1参与了牙鲆的先天免疫反应，并对其具有一定的调节作用。本研究有助于更好地理解PoTAK1在牙鲆抵抗外界病原体入侵过程中的作用机制。

利用蛋白组学技术探究六味地黄丸对卵巢储备功能减退（decrease ovarian reserve， DOR）的治疗效用和可能作用机制。首先采用环磷酰胺60Joint pathology mg·kg~(-1)联合白消安6 mg·kg~(-1)一次性腹腔注射制备DOR模型小鼠，药物注射后连续观察小鼠动情周期，以动情周期紊乱判定造模是否成功。造模成功后，给予小鼠六味地黄丸混悬液连续灌胃28 d；结束后选取4 只雌鼠按照2：1与雄鼠进行合笼观察孕产率；剩余小鼠在灌胃结束后的次日采血、取卵巢。HE染色、透射电镜下观察卵巢形态及超微结构变化；ELISA检测血清激素和氧化水平变化；定量蛋白组学技术分析小鼠造模前后和六味地黄丸干预前后卵巢蛋白的差异表达情况。结果显示，六味地黄丸能够调节DOR小鼠动情周期，改善小鼠血清激素水平，提高Bucladesine体外血清抗氧化水平，促进卵泡发育，保护卵巢颗粒细胞线粒体形态，提高DOR小鼠产仔数和存活数；显著负调节DOR模型相关的12 个差异表达蛋白，这些差异蛋白主要参与了脂质分解代谢、炎症反应、免疫调节、辅酶生物合成等生物过程，并在鞘脂代谢、花生四烯酸代谢、核糖体、细胞MG132铁死亡、cGMP-PKG信号通路等显著富集。总之，DOR的发生和六味地黄丸对其的防治作用与多种生物途径有关，主要包括氧化应激、炎症反应和免疫调节；“线粒体-氧化应激-细胞凋亡”是六味地黄丸治疗DOR的关键；YY1、CYP4F3是引发线粒体功能障碍、ROS积累的关键上游靶点，花生四烯酸代谢通路是药物作用的主要信号通路。

目的 探讨乳腺癌经外周静脉穿刺中心静脉置管(PICC)导管相关性血流感染患者外周血核细胞(PBMCs)中细胞程序性死亡受体1(PD-1)和细胞程序性死亡-配体1(PD-L1)表达水平。方法 选取2018年2月-2021年2月海口市妇幼保健院收治的100例乳腺癌并行PICC患者，根据导管相关性血流感染情况分为感染组23例，未感染组77例ICI 46474 molecular weight，另选取同期健康体检人员49名为对照组。分析三组PD-1/PD-L1表达水平及对导管相关性血流感染预测价值。结果 感染组PD-1表达及PD-1/PD-L1值高于未感染组，未感染组高于对照组；感染组PD-L1表达低于未感染组，高于对照组(P<0.05)。PD-1 mRNA临界值为1.22时预测导管相关性血流感染曲线下面积(AUC)为0.858,敏感度为78.26%,特异性为89.61%。PD-L1 mRNA临界值为0.51,AUC为0.800,敏感度为73.91%,特异性为92.21%。PD-1/PD-L1临界值为2.24,AUC为0.863,敏感度为82.61%,特异性为88.31%;导管留置时间及化疗确认细节次数是患者发生导管相关性血流感染的危险因素(P<0.Medial prefrontal05)。结论 乳腺癌PICC导管相关性血流感染患者外周血PBMCs中PD-1和PD-L1的表达水平较高，检测PD-1、PD-L1及其比值有助于预测PICC置管导管相关性血流感染。