PI3K抑制剂

血管壁干细胞(vascular wall-resident stem cells, VW-SCs)在维持血管正常功能以及损伤血管的修复过程中发挥着关键性的作用，对其功能特性的研究将有助于干细胞的调控及应用。本文旨在建立稳定的VW-SCs分离、培养及分选鉴定技术，为进一步深入研究VW-SCs在生理和疾病状态下的增殖、迁移和分化等机制提供丰富、可靠的细胞来源。首先利用组织块贴壁法获取小鼠主动脉外膜以及肠系膜动脉血管壁Belnacasan使用方法细胞，细胞传代培养到至少1×10~7后经磁珠分选和流式鉴定CD34~+的VW-SCs；其次采用细胞免疫荧光染色检测干细胞标志物(CD34、Flk-1、c-kit、Sca-1)以及平滑肌标记物(SM22、SM MHC)、内皮标记物(CD31)和细胞核内分裂增殖相关蛋白(Ki-67)；血管壁CD34~+干细胞的定向分化采用EBM-2内皮分化诱导培养基和FM-2成纤维细胞培养基分别培养7天和3天；利用细胞免疫荧光染色和q-PCR检测内皮细胞标志物(CDchronic infection31,VWF)和成纤维细胞标志物(Vimentin,PDGFRα)的表达。此外，采用TILLvisION胞内selleck LY2835219钙信号检测系统结合Ca~(2+)荧光探针Fura-2/AM观察CD34~+干细胞胞内钙库Ca~(2+)释放和胞外Ca~(2+)内流特性。结果显示，血管组织块贴壁法和磁珠分选可获取较高纯度(>90%)的小鼠主动脉外膜以及肠系膜动脉血管壁CD34~+干细胞。体外培养的血管壁CD34~+干细胞可诱导分化为内皮细胞和成纤维细胞。咖啡因和ATP可显著激活CD34~+干细胞胞内钙库Ca~(2+)释放，毒胡萝卜素(thapsigargin, TG)耗竭内质网钙库Ca~(2+)后触发钙库操纵的外钙内流(store-operated Ca~(2+)entry, SOCE)。该方法建立了稳定、高效的血管壁CD34~+干细胞分离、培养和鉴定技术，为体外深入研究VW-SCs的调控机制以及靶向药物的筛选提供了保障。

[目 的]随着治疗方Belumosudil溶解度法和药物的增加,皮肤创伤的治疗方法取得了很大的进步,但现有的干预措施仍不能满足当前临床的需要。因此,开发新的促皮肤再生干预策略仍然是当务之急。课题组之前报道了来源于两栖动物的促修复活性肽RL-QN15,具有成为促修复药物的潜力,但仍需进一步深入研究。因此,本研究旨在通过一定的外界手段提升RL-QN15的活性,从而发展基于活性肽RL-QN15的促皮肤创面愈合干预手段,为RL-QN15最终走向临床应用提供一定的研究工作基础。[方 法]通过无乳化剂乳液聚合法合成了空腔聚多巴胺(Hollow Polydopamine,HPDA)纳米粒子,并成功附载了多肽RL-QN15。采用透射电子显微镜、X射线能量色散谱、傅里叶变换红外光谱(Fourier Transform Infrared spectroscopy,FTIR)和 X 射线光电子能谱(X-ray Photoelectron Spectroscopy,XPS)等技术表征了 HPDA纳米粒子和附载RL-QN15的HPDA纳米粒子(HPDA nanoparticles loading with RL-QN15,HPDLY2157299AlR)的特性。采用分光光度计测量不同时间点吸光度来评估HPDA对RL-QN15的附载效率以及HPDAlR对RL-QN15的缓释速率。使用CCK8法和钙黄绿素-乙酰氧甲酯/碘化丙啶(Calcein Acetoxymethyl,Calcein-AM/Propidium Iodide,PI)染色法对 HPDA 纳米粒子以及HPDAlR的细胞毒性进行了检测。通过苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin,H&E)染色对HPDA和HPDAlR在小鼠体内的毒性进行了评估。通过细胞划痕实验评估了 HPDA 和 HPDAlR 对人永生角化细胞(Human Immortalized Keratinocytes,HaCaT)的促修复活性。通过酶联免疫吸附反应(enzyme-linked immunosorption,ELISA)对小鼠-单核-巨噬细胞白血病细胞(Mouse-Monocyte-Macrophage Leukemia Cells,RAW264.7)释放的细胞因子进行了测定。同时我们也对HPDA、RL-QN15和HPDAlR在小鼠全皮层皮肤损伤创面或烧伤、大鼠口腔溃疡和猪全皮层皮肤损伤创面上的组织再生能力进行评价和比较。通过小动物活体成像对HPDA和HPDAlR在小鼠体内的生物分布和清除率进行了观测。通过浸渍法合成了海藻酸锌水凝胶(Zinc Alginate hydrogel,ZA)和包埋有 HPDAlR 的海藻酸锌水凝胶(Zinc Alginate hydroPhotocatalytic water disinfectiongel embedded with HPDAlR,HPDAlR&ZA)。采用扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope,SEM)、FTIR和XPS等技术表征了水凝胶ZA和HPDAlR&ZA的特性。通过观察不同时间点小鼠体内注射水凝胶ZA和HPDAlR&ZA的图片,对水凝胶体内降解性进行了评估。使用Calcein-AM和H&E染色法对HPDAlR&ZA的体内外毒性进行了检测。通过2,2-联氮基双(3-乙基苯基噻唑啉-6-磺酸)-二胺盐(2,2Azino-Bis(3-Ethylbenzothiazoline-6-Sulfonic Acid),ABTS)和 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(2,2-Diphenyl-1-Picrylhydrazyl,DPPH)实验检测了水凝胶 HPDAlR&ZA 的自由基清除活性。通过流式细胞术检测了水凝胶HPDAlR&ZA对人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)产生活性氧自由基(Reactive Oxygen Species,ROS)的影响。通过细胞增殖实验、细胞划痕实验和细胞迁移实验评估了 HPDAlR&ZA的促修复活性。通过ELISA测定了HPDAlR&ZA 对 RAW264.7 释放肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)以及转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)的影响。通过成管实验评估了 HPDAlR&ZA的促血管生成能力。对HPDAlR&ZA在糖尿病小鼠全皮层皮肤损伤创面和糖尿病病人体外皮肤伤口培养模型创面上的组织再生能力进行评价和比较。最后通过免疫荧光和免疫组化等实验手段对HPDAlR&ZA促糖尿病创面愈合机制进行了初步探索。[结 果]第一部分:本文成功制备了 HPDA纳米粒子和HPDAlR纳米复合物。通过HPDA的附载和HPDAlR的缓释作用,RL-QN15不仅可以减少皮肤表面各种酶的降解而且可以维持其有效浓度。HPDA纳米粒子和HPDAlR对HaCaT、RAW264.7和小鼠均无明显毒性,HPDA纳米粒子在体内和体外均无促愈合作用。值得注意的是,HPDAlR显著增强了 RL-QN15加速HaCaT细胞划痕愈合的能力,并选择性地调节RAW264.7细胞释放与愈合相关的细胞因子。更重要的是,与RL-QN15相比,在小鼠皮肤全皮层创伤和大鼠口腔溃疡的动物模型上,HPDAlR的促再生能力分别显著提高了 50倍和10倍。此外,HPDAlR还能提高RL-QN15对小鼠皮肤烫伤和猪全皮肤层损伤创面的愈合效率。第二部分:本文成功制备了 HPDAlR&ZA。HPDAlR&ZA具有清除ROS、ABTS+和DPPH+自由基的能力以及可降解的特性。HPDAlR&ZA对人HaCaT细胞、HUVECs细胞、RAW264.7细胞、人皮肤成纤维细胞(Human Skin Fibroblast,HSF)和小鼠均无明显毒性。HPDAlR&ZA可显著提升RL-QN15和HPDAlR的促进HaCaT细胞、HUVECs细胞和HSF细胞的增殖的能力和HUVECs细胞的迁移和血管生成的能力。HPDAlR&ZA能够调控体外TNF-α和TGF-β1的表达。更重要的是,在糖尿病小鼠皮肤全皮层损伤创伤动物模型以及糖尿病病人体外皮肤伤口培养模型上,HPDAlR&ZA的促修复效果明显强于HPDAlR。此外,通过对两个糖尿病皮肤伤口模型愈合机制的深入探索,发现水凝胶HPDAlR&ZA可通过促MⅠ型巨噬细胞快速极化向MⅡ型巨噬细胞来抵抗炎症反应进而重建血运和增加胶原沉积,快速促进糖尿病创面修复和皮肤再生。[结 论]综上所述,纳米粒子HPDA和水凝胶ZA在体内或外均能明显增强RL-QN15的促再生能力,HPDAlR纳米复合物和HPDAlR&ZA水凝胶在皮肤创面愈合治疗中具有一定的应用潜力。

微生物天然产物及其衍生物为心血管疾病、癌症、细菌和病毒感染等疾病的治疗以及农业生产上的杂草、害虫等防治作出了很大贡献。他们的结构、生物活性及作用机制复杂多样,使其在新型药物开发中具有重要地位。近年来,多重耐药细菌的流行,对新型抗生素等药物的研发提出了更高的需求,然而天然产物出新率低,近几十年来被应用于临床的抗生素中仅有少数具有新骨架。海洋中蕴藏着丰富的生物资源,其独特的低温低氧高盐高压环境使海洋微生物通过次级代谢等产生抗逆作用,从而使代谢产物的合成、结构和INCB28060纯度活性更加新颖。变形杆菌作为海洋中微生物的主要分布类群,能够产生许多具有抗菌、抗病毒、抗生物膜、防污和抗癌活性的天然产物,是活性天然产物的主要来源之一。基因组学和代谢组学分析发现海洋微生物基因组上具有大量隐性次级代谢产物的生物合成基因簇,激活这些隐性合成途径进一步挖掘海洋微生物代谢潜力对于新型天然产物的发现及新药开发具有重要意义。本研究聚焦于海洋变形杆菌金黄色假交替单胞菌Pseudoalteromonas flavipulchra S16中新型活性天然产物的挖掘。对P.flavipulchra S16进行代谢组学和基因组学分析,发现除已知化合物alterochromides的生物合成途径外,基因组上有13个未知天然产物的生物合成基因簇,且大多与已知基因簇的相似度较低,具有合成新型天然产物的潜力。利用ExoCET技术对新颖的沉默基因簇BGC8(40 kb)进行直接克隆和修饰,导入三种异源宿主 E.coli GB05-MtaA、P.putida KT2440和S.brevitaleaselleck DSM 7029 中表达,但未检测到新化合物产生。因此,我们通过单交换重组对P.flavipulchra S16基因组上的沉默基因簇进行原位激活,将两种启动子Palt和Pery分别插入BGC8核心基因上游,但仍未产生新的产物。然后我们对菌株S16进行了转录组测序,对WPB biogenesis内源型强启动子进行了活性分析和筛选,并将其用于沉默基因簇的原位激活。对不同培养时间点的P.flavipulchra S16进行转录组测序,选择33个转录水平位于前3.3%的基因上游的启动子作进一步分析。分别将33个内源启动子亚克隆到自杀载体pR6K-attP-phiC31-fluc上,并整合在荧光素酶报告基因fluc上游。同时通过单交换重组及SacB反向筛选将attB位点整合到菌株S16基因组上已知化合物alterochromides生物合成基因簇的核心区域,在引入attB位点的同时对alterochromides生物合成途径进行了失活,以构建荧光素酶基因定点整合且代谢背景较低的突变菌株。之后将带有不同启动子和fluc基因的质粒转入菌株S16,通过PhiC31整合酶介导attB与attP的位点特异性重组将启动子筛选质粒整合到基因组上。然而,由于PhiC31定点整合系统在菌株S16中效率非常低或不能工作,只获得了含有P7启动子的质粒通过启动子区域的单交换重组整合到基因组上的重组菌株。于是将带有启动子和fluc基因的自杀质粒的pR6K复制子替换为可复制的pBR322复制子并通过接合转移将质粒导入P.flavipulchra S16中,荧光素酶活性测定表明启动子P7、P18、P29和P32具有较高的活性。为了进一步验证内源启动子的有效性,本研究通过单交换重组和SacB反向筛选将P7启动子插入P.flavipulchra S16基因组上7个沉默基因簇的上游,包括4个PKS/NRPS杂合基因簇 BGC1、BGC3A、BGC8、BGC7 和 3 个 NRPS 基因簇 BGC2、BGC3B、BGC9。对发酵粗提物进行HPLC-MS分析发现BGC9被成功激活,产生了多个新化合物,化合物的结构、生物活性和生物合成机制有待进一步研究。本研究利用启动子筛选和基因组编辑,在P.flavipulchra S16中成功建立了隐性次级代谢产物的挖掘体系,为P.flavipulchra S16和其他海洋细菌的活性次级代谢产物挖掘提供了有效的途径。

目的:最新研究数据显示,乳腺癌已成为目前全球发病率最高的恶性肿瘤,是女性最主要的死因之一。乳腺癌现有的常规治疗手段主要包括手术治疗,化疗,内分泌治疗,靶向治疗,免疫治疗及放疗等。这些治疗手段明显降低了乳腺癌患者的复发和死亡风险,使乳腺癌患者的预后得到了有效地改善。但仍有部分患者缺乏有效的治疗靶点,并且在药物治疗后可能出现肿瘤异质性,导致患者发生治疗耐药和肿瘤进展。乳腺癌增殖能力强和对药物治疗的耐药性等恶性生物学行为是导致患者疗效不佳,进展快且预后较差的关键因素。因此,寻找新的生物标志物用于预测乳腺癌患者预后,并探索新的治疗靶点用于乳腺癌治疗并克服肿瘤治疗耐药具有十分重要的意义。袢状核酸内切酶1(flap endonuclease 1,FEN1)是一种二价金属离子依赖的结构特异性的核酸酶,由N端结构域、中间结构域、C端结构域和一个扩展的C端结构域组成,具有核酸内切酶、5′-3’核酸外切酶和切口核酸内切酶三种生物学活性。FEN1通过在3’-flap附近形成疏水结构优先结合5’-flap结构,以此定位到flap结构底部,进行精准切割。因此,FEN1在冈崎片段的成熟、长片段碱基切除修复、端粒稳定性的维持、凋亡DNA降解及停滞复制叉的修复等多种DNA代谢途径中发挥着重要的作用。FEN1与肿瘤的发生发展也密切相关。既往多项研究发现,FEN1在肺癌、乳腺癌、胰腺癌及胃肠道肿瘤等多种恶性肿瘤组织中表达升高。FEN1过表达可以导致正常乳腺上皮细胞发生恶性肿瘤表型的转变。FEN1还可以促进肿瘤细胞增殖和细胞周期进展,抑制细胞凋亡,并降低肿瘤细胞对顺铂、替莫唑胺、紫杉醇及他莫昔芬等药物的敏感性。FEN1高表达可能提示肿瘤患者预后不良。这些结果表明,FEN1是恶性肿瘤进展中的关键作用分子,探究其在肿瘤中的功能和机制可能为肿瘤的防治和新药物的研发开拓新的思路。在乳腺癌中,FEN1可能是一种重要的生物标志物。但目前关于FEN1与乳腺癌的临床相关性研究尚未得出一致的结论。此外,尽管已有的研究表明,FEN1能够促进乳腺癌细胞的生长和增殖,并影响乳腺癌细胞对化疗的敏感性,但FEN1在乳腺癌细胞增殖和化疗耐药中的具体机制尚未完全明确。本研究旨在分析FEN1在乳腺癌中的预后价值和功能,通过筛选FEN1的相互作用蛋白,揭示FEN1在乳腺癌细胞增殖和化疗耐药中的作用机制。本研究明确了乳腺癌中新的预后标志物和治疗靶点,为乳腺癌增殖和耐药的机制研究提供了新的方向,并为未来制定新的乳腺癌治疗策略提供依据。研究方法:1.利用KM plotter在线数据库分析FEN1表达与无复发生存期(relapse-free survival,RFS)和总生存期(overall survival,OS)的关系;2.通过免疫组化实验分析乳腺癌患者组织芯片中FEN1表达与OS及各临床病理特征的相关性;3.下载肿瘤基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中的数据,分析FEN1表达与各临床病理因素的相关性;4.利用TCGA数据库中的数据,筛选FEN1表达的相关基因,通过京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome,KEGG)分析FEN1相关的功能和通路;5.通过免疫共沉淀结合质谱分析方法探索FEN1的相互作用蛋白,利用Networkanalyst在线网站构建蛋白相互作用网络;6.利用质谱分析中检测的FEN1的相互作用蛋白进行基因本体论(Gene Ontology,GO)分析和KEGG分析,分析FEN1的作用靶点和功能通路;7.利用免疫共沉淀(immunoprecipitation,IP)实验验证FEN1与TATA元件调节因子1(TATA element–modifying factor 1,TMF1)的相互作用;8.利用免疫荧光实验检测FEN1与TMF1在细胞内的共定位;9.通过免疫组化实验分析乳腺癌患者组织芯片中FEN1表达与TMF1表达的相关性;10.利用q RT-PCR实验和Western bEmbryo biopsylot实验检测TMF1和FEN1的表达情况及si RNA和过表达质粒的转染效率;11.利用GEPIA2和UALCAN在线数据库分析TMF1的表达情况;12.利用KM plotter在线数据库分析TMF1表达与RFS、OS和无远处转移生存期(distant metastasis-free survival,DMFS)的关系;13.通过免疫组化实验分析乳腺癌患者组织芯片中TMF1的表达情况,及TMF1表达与患者OS的相关性;14.利用TCGA数据库中的数据,通过GSEA功能富集分析TMF1相关的功能和通路;15.利用MTS实验检测乳腺癌细胞活力;16.利用集落形成实验检测乳腺癌细胞增殖能力;17.利用Western blot实验检测FEN1及TMF1沉默或过表达后ERK和磷酸化ERK的蛋白表达情况;18.利用Western blot实验检测敲减FEN1及顺铂处理后p62、、LC3B I、LC3B II、TOM20、TIM23和Cleaved Caspase 3等蛋白的表达情况;19.裸鼠皮下成瘤实验验证FEN1和TMF1对乳腺癌细胞体内生长的作用;20.通过GFP-m Cherry-LC3免疫荧光实验检测敲减FEN1后细胞中自噬流的变化;21.通过GST pull-down实验验证FEN1与Beclin 1之间的结合;22.通过mt-Keima荧光方法检测损伤线粒体的清除情况;23.利用TMRM法通过流式细胞术实验检测线粒体的膜电位情况;24.利用DCFH-DA染色方法通过流式细胞术实验检测线粒体活性氧(reactive oxygen species,ROS)的水平;25.通过免疫荧光法检测细胞核中γH2AX的聚集,判断DNA损伤情况;26.流式细胞术实验检测顺铂处理后的细胞凋亡情况;27.利用Graph Pad Prism软件(V 8.0.2)和SPSS 24.0软件进行统计学分析。使用Student’s-t检验和one-way ANOVA方法进行两组或多组间比较。P<0.05被认为具有统计学意义。结果:第一部分:1.FEN1高表达的乳腺癌患者预后不良。在线数据分析表明FEN1 m RNA高表达的乳腺癌患者RFS和OS较差。同时通过免疫组化的方法分析乳腺癌患者组织中FEN1的蛋白表达水平,生存分析结果提示FEN1高表达与患者OS较短相关,且进一步的多因素分析表明FEN1高表达是乳腺癌患者OS的独立预后不良因素;2.FEN1高表达与乳腺癌患者肿瘤较大及分期晚等侵袭性特征相关。乳腺癌患者组织芯片分析结果显示FEN1蛋白表达与年龄、分期、淋巴结转移及分子分型等临床特征无显著的相关性。而利用TCGA数据进行的相关性分析结果提示FEN1 m RNA水平高表达与乳腺癌患者肿瘤大小和疾病分期显著相关;3.FEN1与乳腺癌细胞增殖和生长信号调控相关。在TCGA数据集中筛选与FEN1表达相关的基因进行KEGG功能富集分析发现,这些基因在细胞周期、细胞衰老和p53信号等通路显著富集。此外,利用TCGA表达谱数据进行GSVA分析发现,FEN1表达与肿瘤增殖、DNA修复、G2/M检查点、MYC信号及DNA复制通selleck抑制剂路显著正相关;4.FEN1可能参与乳腺癌中细胞自噬过程。通过免疫共沉淀结合质谱分析的方法筛选出了FEN1潜在的相互作用蛋白,并构建了FEN1相关蛋白相互作用图谱。对这些潜在的相互作用蛋白进行GO分析和KEGG分析发现,FEN1与细胞内吞、吞噬体、自噬、内质网蛋白质加工和抗原加工呈递等生物学过程相关。第二部分:1.乳腺癌细胞中FEN1与TMF1存在相互作用。免疫共沉淀结合质谱分析结果提示TMF1可能是FEN1的相互作用蛋白。在乳腺癌细胞株中通过IP实验验证了TMF1是FEN1的相互作用蛋白。同时,应用免疫荧光实验观察到了FEN1与TMF1在乳腺癌细胞内的共定位;2.免疫组化实验结果显示在乳腺癌患者组织中FEN1与TMF1的表达Q-VD-Oph抑制剂呈显著的正相关;3.FEN1上调TMF1的蛋白水平表达。利用si RNA下调TMF1表达后,FEN1的m RNA和蛋白表达无明显变化。而沉默FEN1后,TMF1的m RNA水平无明显变化,蛋白水平表达明显下降。反之过表达FEN1后,TMF1的蛋白表达明显增加;4.FEN1可以维持TMF1的蛋白稳定性。沉默FEN1后,TMF1的蛋白降解速率明显加快;5.FEN1抑制了溶酶体介导的TMF1蛋白降解。下调FEN1引起的TMF1蛋白表达减低可以被氯喹二磷酸盐(chloroquine diphosphate salt,CQ)逆转,而蛋白酶体抑制剂MG132则没有表现出这种逆转作用;6.在线数据分析结合乳腺癌患者组织免疫组化实验分析发现,TMF1在乳腺癌中的表达水平显著高于正常乳腺组织,且TMF1高表达与乳腺癌患者预后不良相关;7.FEN1通过稳定TMF1促进乳腺癌细胞增殖。沉默TMF1后,乳腺癌细胞增殖能力受到抑制。反之,过表达TMF1后,乳腺癌细胞增殖能力增强。且沉默TMF1能够抑制FEN1对乳腺癌细胞增殖的促进作用;8.TMF1通过激活MEK/ERK信号通路促进乳腺癌细胞增殖。下调TMF1表达后,p-ERK水平降低,反之过表达TMF1后,p-ERK表达水平升高。MEK1/2抑制剂PD98059可以逆转TMF1导致的乳腺癌细胞增殖能力增强;9.FEN1通过TMF1激活MEK/ERK信号通路。过表达FEN1后,乳腺癌细胞中p-ERK水平升高,同时下调TMF1表达后,p-ERK水平则明显降低。沉默TMF1逆转了FEN1导致的MEK/ERK信号激活;10.FEN1通过TMF1促进乳腺癌细胞体内生长。裸鼠皮下成瘤实验显示,过表达FEN1的肿瘤体内增殖速度明显更快,体积更大,重量更重。同时沉默TMF1后,肿瘤增殖速度减慢,体积减小,重量也减轻。第三部分:1.沉默FEN1能够抑制顺铂诱导的乳腺癌细胞自噬水平。敲减FEN1抑制了顺铂诱导的p62的蛋白降解和LC3B II型的增加。并且,GFP-m Cherry-LC3免疫荧光实验结果表明,在顺铂作用下同时沉默FEN1,细胞中自噬体及自噬溶酶体数量均明显减少;2.FEN1通过竞争性结合Beclin 1的BH3结构域,阻断了Bcl-2对Beclin 1的抑制作用。GST pull-down实验表明乳腺癌细胞中FEN1与Beclin 1直接结合,且在顺铂作用下,FEN1与Beclin1的结合增强。在缺失了BH3结构域后,FEN1与Beclin 1的结合明显较弱。在顺铂作用下,沉默FEN1后Beclin 1与Bcl-2的结合则明显增强;3.FEN1通过介导线粒体自噬清除线粒体损伤,维持细胞内的线粒体稳态。在顺铂作用下,沉默FEN1后乳腺癌细胞内损伤线粒体的清除减少,线粒体特异性蛋白TOM20和TIM23表达增加,细胞内低电位受损线粒体数量明显增加;4.FEN1介导的线粒体自噬参与了细胞内氧化还原稳态的维持。在顺铂作用下,沉默FEN1导致乳腺癌细胞内ROS水平明显升高;5.FEN1介导的自噬抑制顺铂诱导的DNA损伤和细胞凋亡。在顺铂作用的情况下,沉默FEN1后细胞核内γH2AX聚集明显增加,Cleaved Caspase 3表达升高,凋亡细胞数量也明显增加。结论:1.FEN1高表达是乳腺癌患者的预后不良因素,与乳腺癌侵袭性表型相关;2.FEN1可能通过调控乳腺癌细胞增殖和自噬等过程影响乳腺癌进展;3.FEN1通过TMF1激活MEK/ERK信号通路,从而促进乳腺癌细胞增殖;4.FEN1通过Beclin1调节细胞自噬,介导乳腺癌顺铂耐药。

目的 了解南宁市江南区9种呼吸道感染病原体的IgM抗体检测结果Pidnarulex临床试验及流行情况。方法 采用间接免疫荧光法，检测2020年6月至2021年5月就诊于该院及其分院的5 632例患者的9种呼吸道病原体IgM抗体，并从年龄、性别和季节等方面分析其抗体的检出情况。结果 5 632例标本的9种呼吸infections: pneumonia道感染病原体IgM抗体总阳性率为18.04%(1 016/5 632),单一病原体IgM抗体阳性率为15.48%(872/5 632),混合病原体IgM抗体阳性率为2.56%(144/5 632);其中肺炎支原体(MP)为IgM抗体阳性率最高的病原体，其次为副流感病毒(PIV)。从年龄分组来看，0～12岁组呼吸道感染病原体IgM抗体阳性率最高，其次为>12～59岁组，最低为>59岁组，三组间差异有统计学意义(χ~2=167.23,P<0.05);从性别来看，女性呼吸道感染病原体IgM抗体阳性率高于男性(χ~2=63.58,P<0.05);各季节之间呼吸道病原体IgM抗体阳性率比较差异均无统计学意义(χ~2=4.72,P=0.19)。结论 MP及PIV是南宁市江南区呼吸道感染患者的主要病原体，女性及低龄儿童是呼吸道感染的易感人群；建议相关部门做NVP-TNKS656分子量好重点人群的防范工作，预防相应病原体的流行和传播。

目的 探讨和厚朴酚(honokiol, HKL)对糖尿病(diabetes mellitus, DM)大鼠血糖及胰岛素抵抗的影响，以及对过氧化物酶增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptors γ,PPARγ)/腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase, AMPK)信号通路的调节作用。方法 70只大鼠随机分为正常组(15只)和DM组(55只),正常组大鼠用普通饲料喂养，DM组大鼠用高脂高糖饲料喂养，6周后，禁食12 h,测定空腹血糖(fasting blood glucose, FBG),FBG≥11.1 mmol·L~(-1)视为造模成功，正常组和DM组大鼠各取5只测定腹膜脂肪组织中PPARγ mRNA的相对表达量，剩余48只DM大鼠随机分为模型组、和厚朴酚组、抑制剂组及和厚朴酚+抑制剂组，每组12只。和厚朴酚组大鼠用HKL 50 mgDorsomorphin·kg~(-1)·d~(-1)灌胃，抑制剂组大鼠用GW9662 1 mg·kg~(-1)·d~(-Baricitinib1)灌胃，和厚朴酚+抑制剂组大鼠先用HKL 50 mg·kg~(-1)灌胃，2 h后，再用GW9662 1 mg·kg~(-1)·d~(-1)灌胃，连续处理3周。用qRT-PCR检测脂肪组织中PPARγ mRNA的相对表达量，测定FBG和体质量，用ELISA检测血清胰岛素(fasting serum insulin, FINS),计算胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment-insulin resistance index, HOMA-IR)和胰岛素敏感指数(insulin sensitivity index, ISI),用蛋白印迹法检测p-AMPK、PPARγ蛋白的相对表达量。结果 与正常组比较，DM组大鼠脂肪组织中PPARγ mRNA的相对表达量降低(P<0.05)。与正常组比较，模型组大鼠PPARγ mRNA的相对表达量、ISI、p-AMPK和PPARγ蛋白的相对表达量降低，体质量减轻，FBG、FINS和HOMA-IR升高(P<0.05);与模型组比较，和厚朴酚组大鼠PPARγ mRNA的相对表达量、ISI、pImmunocompromised condition-AMPK和PPARγ蛋白的相对表达量升高，体质量增加，FBG、FINS和HOMA-IR降低，抑制剂组大鼠PPARγ mRNA的相对表达量、ISI、p-AMPK和PPARγ蛋白的相对表达量降低，体质量减轻，FBG、FINS和HOMA-IR升高(P<0.05);与和厚朴酚组比较，和厚朴酚+抑制剂组大鼠PPARγ mRNA的相对表达量、ISI、p-AMPK和PPARγ蛋白的相对表达量降低，体质量减轻，FBG、FINS和HOMA-IR升高(P<0.05);与抑制剂组比较，和厚朴酚+抑制剂组大鼠PPARγ mRNA的相对表达量、ISI、p-AMPK和PPARγ蛋白的相对表达量升高，体质量增加，FBG、FINS和HOMA-IR降低(P<0.05)。结论 HKL降低DM大鼠血糖水平、改善胰岛素抵抗，其可能是通过激活PPARγ介导AMPK信号通路发挥调节作用。

鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus, AngHV)是鳗鲡(Anguilla)的一种重要病毒性病原，可引起养殖鳗鲡暴发“脱黏败血综合征”，给养殖者造成巨大的经济损失。开展AngHV的免疫原性蛋白研究对于开发AngHV的免疫学诊断技术及亚单位疫苗具有重要意义。为了获得鳗鲡疱疹病毒的免疫原性蛋白，本研究通过质谱分析AngHV病毒粒子结构蛋白，筛选到ORF36，对其氨基酸序列进行生物信息学分析，克隆至原核表达载体进行诱导表达；用纯化的重组表达蛋白制备兔抗多克隆抗体，评价该抗体检测AngHV的特异性、灵敏性Enfermedad cardiovascular以及病毒中和效果，并对ORF36进行病毒粒子结构定位。结果显示，通过质谱鉴定出病毒的主要免疫原性蛋白ORF36；序列分析显示，ORF36无跨膜结构域，不含有信号肽，具有13个B细胞抗原表位，免疫原性良好；克隆ORF36至原核表达载体pET-30a，实现了其在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中的高效表达，重组表达蛋白大小约为40 kD;ELISA检测显示，制备的兔抗ORF36多克隆抗体效价为1∶8 000;Western blot结果显示，该抗体能特异性识别感染AngHV的鳗鲡卵巢细胞系(eel ovary cell line, EO)及鳗鲡组织，最低可检测的内脏组织的病毒量为1 000 PFU；抗体中和试验表明，制备的兔抗ORF36多克隆抗体具有中和作用，能显著降低AngHV的病毒滴度；selleck抑制剂ORF36的病毒粒子定位分析表明，ORF36是病毒粒子的结构蛋白且定位于核衣壳上。本研究鉴定出病毒的主要免疫原性蛋白ORF36，制备了具有病毒中和作用的ORF36多克隆抗体，明确了ORF36为AngHselleck Compound CV核衣壳结构蛋白，为阐明ORF36在AngHV侵染过程中的作用及开发病毒亚单位疫苗提供了参考。

目的：研究波形蛋白（Vimentin）与肝细胞癌（HCC）的关系及健脾益气方通过Vimentin调控肝癌的分子机制。方法：利用基于TCGA和CPTAC数据的在线分析平台、STRING数据库及Cytoscape软件分析Vimentin与肝细胞癌的关系。随机将SD大鼠分为正常组，模型组，健脾益气方低、中、高剂量组（5.25、10.5、21 g·kg~(-1)），信号转导蛋白及转录激活子3（STAT3）抑制组（C188-9，4.5 mg·kg~(-1)）和糖蛋白130（gp130）抑制组（SC144，4.5 mg·kg~(-1)），每组10只。除正常组外，其余各组大鼠按照70 mg·kg~(-1)体质量腹腔注射二乙基亚硝胺（DEN）复制肝癌模型。造模成功后，正常组和模型组大鼠生理盐水灌胃，健脾益气方低、中、高剂量组分别给予对应剂量中药灌胃，两个抑制组分别腹腔注射对应抑制剂，每日1次，连续4周。末次处置后，采用实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）方法检测大鼠肝组织中VIM mRNA水平；比色法检测肝组织胱天蛋白酶-3（Caspase-3）酶活性；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测肝组织中Rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶1（ROCK1）、Rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶2（media reportingROCK2）、aurora 激酶B（AURKB）、锌指蛋白148（ZNF148或者ZBP-89）、STAT3、磷酸化STAT3（p-STATTamoxifen3）、总Vimentin、磷酸化Vimentin（p-Vimentin）以及肝组织细胞核中Vimentin蛋白含量；酶联免疫吸附测定（ELISA）检测大鼠血清中Vimentin的含量。结果：VIM mRNA在肝癌患者不同病理分期（I-Ⅳ期）、不同病理分级（G1-G3级）、无区域淋巴结转移患者（N0）和肝癌不同亚型患者组织中表达水平均显著升高（P<0.01）；Vimentin蛋白水平在肝癌组织中显著降低（P<0.01）；VIM mRNA高表达/低表达对HCC患者总体生存期（OS）、无病生存期（DFS）的影响差异无统计学意义（P>0.05）；VIM基因有4处突变可以导致Vimentin蛋白一级结构的改变，这些遗传突变可降低患者DFS（P<0.001）；VIM mRNA的表达水平与HCC纯度呈负相关（P<0.001），而与微环境中肿瘤相关成纤维细胞、M2型巨噬细胞和髓系树突状细胞等的浸润水平呈正相关（P<0.001）。关联分析结果显示Vimentin与STAT3在HCC患者肝癌组织中的表达存在一定相关性（P<0.0001）。动物实验结果显示，与正常组比较，模型组大鼠肝组织中VIM mRNA、总Vimentin、p-Vimentin和核Vimentin蛋白水平、血清中分泌型Vimentin水平、肝组织中ROCK2、AURKB、STAT3和p-STAT3蛋白水平均显著上调（P<0.01）；负调控分子ZBP-89蛋白水平显著降低（P<0.01）；Caspase-3酶活性升高、ROCK1蛋白表达水平增加，但是差异无统计学意义（P>0.05）。STAT3抑制剂和gp130抑制剂以及中、高剂量健脾益气方均可显著降低大鼠血清中分泌型Vimentin水平，肝组织中总Vimentin、p-Vimentin和核Vimentin蛋白水平，及STAT3/Vimentin信号通路主要相关分子STAT3、p-STAT3、ROCK2、AURKB的蛋白水平，上调负调控分子ZBP-89蛋白水平和Caspase-3酶活性（P<0.05或P<0.01），且中剂量或高剂量健脾益气方对VIM mRNA水平、STAT3蛋白、ZBP-89蛋白、ROCK2蛋白和AURKB蛋白水平，及Caspa获悉更多se-3酶活性的干预结果，与STAT3抑制剂相比差异均不具有统计学意义（P>0.05）。结论：Vimentin是肝癌组织中一种重要的炎症分子，其表达、细胞定位和功能可能受肿瘤相关成纤维细胞、M2型巨噬细胞和髓系树突状细胞浸润水平，及IL-6/STAT3信号、特别是STAT3分子的影响；而健脾益气方可能通过干预STAT3/Vimentin信号通路调控Vimentin而防治肝癌。

目的：探究溶质载体家族22成员11(SLC22A11)在乳腺浸润癌（BRCA）进展中的作用和可能的调节机制。方法：通过Oncomine、UALCAN、TCGA、TIMER和Kaplan-Meier Plotter数据库探究SLC22A11在BRCA组织中的表达，及其在BRCA患者预后中的作用和进展中的潜在机制。在TIMER数据库中探究SLC22A11表达水平与BRCA免疫细胞浸润间的关系。结果：在BRCA组织中SLC22A11 mRNA表达水平显著降低，而SLC22A11甲基化水平显著Immune contexture升高，两者表达水平呈负相关。SLC22A11表达水平降低与BRCA患者种族、性别、年龄、TNBC亚型、组织学亚型、Menopause状态、淋巴结转移和TP53突变相关。SLC22A11甲基化水平升高与BRCA患者种族、年龄、淋巴结转移和TP53突变相关。SLC22A11表达水平降低VX-445纯度与BRCA患者总生存期和无复发生存期相关，且与BRCA患者无复发生存期相关的ER阳性、ER阴性、HER2阴性、淋巴结阴性、Basal-like型、Her-2过表达型、luminal A型和luminal B型相关。基因富集分析显示MAPK信号通路、细胞因子与细胞因子相互作用、ABC转运蛋白、JAK STAT信号通路、VEGF信号通路、MTOR信号通路、Calcium信号通路等富集于SLC22A11高表达组。SLC22A11表达水平与BRCA纯度、B细胞、CD8+T细胞和CD4+T细胞水平相关，且与免疫细胞标志物CD79A、CD19、STAT4表达水平等显著相关。结论：SLC22A11在BRCA组织中表达降低，提高SLC22A11表达水平有望改善BRCA患者预后。此外，SLC22A11表达水平与BRCA免疫细胞浸润及其标志物分子水平相关，提示SLC22A11有望成为BRCA患者治疗的新点击此处靶点。

背景：全膝关节置换后存在感染、心律失常、肺栓塞、心力衰竭、深静脉血栓形成等并发症，而静脉血栓栓塞症是引起手术失败的重要危险因素，因此有效的术后血栓监测尤为重要。目的：探讨血栓分子标志物在全膝关节置换患者术后并发静脉血栓栓赛的预警价值。方法：回顾性分析2021medicinal value年4-7月在河北省中西医结合医院行全膝关节置换患者的病历资料，共纳入80例患者，以术后3 d血栓是否形成分为血栓组(n=39)与无栓组(n=41)，选择同期健康体检者40名作为对照组。3组均检测血清血栓分子标志物水平(凝血酶-抗凝血酶复合物、纤溶酶-α2纤溶酶抑制物复合物、血栓调节蛋白、组织型纤溶酶原激活剂-纤溶酶原激活剂抑制剂1复合物)，全膝关节置换患者于术前当天与术后8 h检测，对照组检测1次。结果与结论：(1)术前当天：无栓组患者的凝血酶-抗凝血酶复合物、纤溶酶-α2纤溶酶抑制物复合物水平均高于对照组(P <0.05)，血栓组患者的凝血酶-抗凝血酶复合物和血栓调节蛋白水平均高于无栓组(P <0.05)，血栓组患者4种血栓分子标志物水平均高于对照组(P <0.05);(2)术后8 h：血栓组患者的血栓分子标志物水平均高于无栓组(P <0.05);(3)Logistics回归分析显示，术前单指标血栓调节蛋白的预测效能最好(ACU=0.814，灵敏度76.70%，特异度83.80%,P=0.00CP-690550体外0)，凝血酶-抗凝血酶复合物和血栓调节蛋白联合检测提高了预测效能(ACU=0.822，灵敏度83.30%，特异度76.80%,P=0.000)；术后单指标凝血酶-抗凝血酶复合物的预测效能最好(ACU=0.898，灵敏度83.30%，特异度84.80%,P=0.000)，凝血酶-抗凝血酶复合物和纤溶酶-α2纤溶酶抑制物复合物联合检测提高了预测效能(ACU=0.897，敏感度88.30%,P=0.000);(4)Spearman直线相关分析显示，术后组织型纤溶酶原激活剂-纤溶酶原激活剂抑制剂-1复合物与纤溶酶-α2纤溶酶抑制物复合物呈现出良好的正相关(r2=0.209,P<0.05);(5)血栓调节蛋白可作为全膝关节置换术前的早期预警指标，凝血酶-抗凝血酶复合物作为临近静脉血栓栓塞发生的特异指标SB203580临床试验，4种指标联合检测能提升深静脉血栓栓塞的预警效能。