PI3K抑制剂

近年来,对健康问题的关注迫使人类对环境污染问题更加重视。过氧化氢(H_2O_2)和汞离子(Hg~(2+))是环境中常见的两种有毒有害物质,过量的H_2O_2和Hg~(2+)不仅对生态环境造成损害,还会破坏生物体内氧化还原平衡,导致细胞氧化损伤,或者损害中枢神经系统、消化系统,造成多器官衰竭,引起阿尔兹海默症、肿瘤、心血管疾病、亨廷顿病和帕金森病等多种疾病。因此,精确监测环境中的H_2O_2和Hg~(2+)显得尤为紧迫。本论文针对H_2O_2和Hg~(2+)的仪器分析技术存在的诸如需要昂贵的仪器、复杂的样品前处理程序、检测时间长、无法实现生物成像等缺点,分别设计开发了能用于H_2O_2和Hg~(2+)特异性识别的分子荧光探针HBTH和MTRH,并将其应用于目标物的宏观环境检测和微观内环境生物成像等应用研究。探针具有合成简单、响应迅速、灵敏度高、生物相https://www.selleck.cn/products/sch772984.html容性好等特点,适于环境和人体微环境中H_2O_2和Hg~(2+)选择性检测。首先,基于ESIPT机理,开发了一种具有大Stokes位移的比率型近红外荧光探针HBTH用于H_2O_2的检测。在PBS与乙腈的混合溶液中(7:3,v/v,10 m M,p H=7.4),探针HBTH对H_2O_2具有较高的荧光检测灵敏度(检出限2.9×10~(-8)M)和选择性,其他共存的干扰离子、生物硫醇和活性氧成分不会对荧光检测产生干Ipatasertib使用方法扰;响应迅速,可在15分钟内完成对H_2O_2的检测;较大的Stokes位移有利地降低了荧光自猝灭带来的影响,提升检测准确度。通过高分辨质谱和DFT理论计算,研究了该探针对H_2O_2的识别机理;利用该探针,实现了真实水样中H_2O_2的检测并获得良好的回收率(93.3%～110.5%),相对标准偏差介于(0.55%Experimental Analysis Software～7.50%)。同时,将该探针成功应用于细胞中和斑马鱼中外源性和内源性H_2O_2的荧光成像以及小鼠组织中的H_2O_2成像,说明HBTH作为H_2O_2的特异性检测探针具有较好的应用前景。其次,通过简单的两步反应设计并合成了一种能选择性检测Hg~(2+)的“OFF-ON”型荧光探针MTRH。该探针在纯水体系中对Hg~(2+)表现出良好的荧光选择性和检测灵敏度,检出限达到1.3×10~(-9) M。同时,探针与Hg~(2+)共存体系的颜色从无色变为粉红色,可以实现对Hg~(2+)的肉眼识别;通过Job’s plot曲线和DFT理论计算验证了MTRH对Hg~(2+)的识别机理。在通过MTT细胞毒性实验,验证了MTRH具有低细胞毒性和良好的生物相容性的基础之上,将MTRH成功应用于Hela细胞中Hg~(2+)的成像,证实了MTRH在复杂生物内环境中Hg~(2+)成像的能力。

苹果是人们日常生活中最常见的水果,在贮藏和运输过程中极易受到损伤,从而被病Ubiquitin抑制剂原真菌侵染。扩展青霉(Penicillium expansum)引起的青霉病是苹果最主要的采后病害之一,造成的腐烂损失也非常严重。目前,对苹果采后青霉病的防治主要依赖化学杀菌剂,虽然防治效果好,但存在着食品安全、诱导抗药性菌株产生和环境药物残留污染等问题。因此,研发安全性高、控制效果好的病害防治方法具有重要的意义。ε-聚赖氨酸(Epsilon-poly-L-lysine,ε-PL)是一种天然的食品防腐剂,进入人体后可分解为人体必需的赖氨酸,安全无毒。ε-PL在柑橘、冬枣和番茄等果实采后病害防治中的应用研究已开展,但其对苹果采后病害防治效果的研究较为罕见。为探索安全、高效的苹果采后青霉病控制方法,本论文研究了ε-PL对苹果采后青霉病的防治效果,揭示了ε-PL体外抑制P.expansum的可能机制,并在生理生化、组学水平结合基因功能验证,揭示了ε-PL控制苹果采后青霉病的生理机制和分子机制。研究结果可为苹果采后青霉病的防控提供了新的思路和理论参考,具有较好的理论意义和实际应用价值。论文主要研究结果如下:(1)ε-PL对苹果的诱导处理能有效控制苹果的自然腐烂及由苹果损伤接种引起的腐烂,且对苹果的贮藏品质无不良影响。体外试验表明,ε-PL对P.expansum的抑制效力与其浓度呈正相关,浓度在200 mg/L以上对P.expansum孢子萌发、芽管伸长及菌丝生长具有显著的抑制作用。体内试验表明,600 mg/L的ε-PL对苹果采后青霉病具有最佳的控制效果。ε-PL诱导处理效果优于直接处理,最佳诱导浓度为600 mg/L,最佳诱导时间为24 h。ε-PL在苹果体内对P.expansum的控制效果与接种孢子的浓度呈负相关,600 mg/L的ε-PL诱导处理苹果可以显著控制由低浓度孢子引起的青霉病,但对高浓度孢子引起的青霉病控制效果减弱。(2)ε-PL对苹果采后青霉病的控制是由ε-PL对P.expansum孢子完整性的破坏、诱导苹果分泌的抗性酶和抗性物质共同作用的结果。ε-PL体外处理P.expansum会导致其孢子内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的迸发,过量的ROS会氧化损伤孢子细胞膜,使大量胞内物质泄漏,从而抑制孢子萌发和菌丝生长。在苹果体内,ε-PL既能有效抑制P.expansum孢子萌发和芽管伸长,也能激发苹果组织的系统抗性反应,600 mg/L的ε-PL能诱导苹果抗性相关的多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)、过氧化物酶(Peroxidase,POD)、苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase,PAL)和几丁质酶(Chitinase,CHI)活性的提高及其编码基因的上调表达,也能诱导苹果分泌总酚、类黄酮和木质素等抗性相关物质,增强其对青霉病的抗性。(3)ε-PL处理增强苹果对青霉病的抗病能力,与其调节苹果的呼吸代谢、ROS代谢和膜脂代谢有关。ε-PL处理能提高苹果呼吸代谢关键酶的活性,主要包括EMP和TCA途径中限速酶的活性以及呼吸链细胞色素c氧化酶(Cytochrome oxidase,CCO)的活性,加速EMP、TCA及呼吸链进程,从而提高苹果的ATP、ADP含量和能荷(Energy charge,EC)水平,增强苹果对青霉病的抗病能力。ε-PL处理可以诱导提高苹果ROS代谢相关抗氧化酶活性,有效清除苹果机体内过多的超氧阴离子(O_2~(-·))、H_2O_2和丙二醛(Malondialdehyde,MDA),减少ROS对苹果细胞膜的氧化损伤。此外,ε-PL处理能有效抑制膜脂代谢中促进膜脂降解的磷High-Throughput脂酶D(Phospholipase D,PLD)、脂氧合酶(Lipoxygenase,LOX)和酯酶的活性,降低磷脂的水解程度,保护细胞膜的完整性。(4)ε-PL可以通过调节苹果代谢通路中抗性相关基因的表达,来提高苹果对青霉病的抗性。转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq)结果分析表明,ε-PTamoxifen化学结构L可以诱导苹果在ROS信号转导、Ca~(2+)信号转导、PAMP触发免疫反应(PAMP-triggered immunity,PTI)和效应蛋白触发的免疫反应(Effector-triggered immunity,ETI)启动过程中以及ROS合成途径中相关基因的上调表达,从而促进ROS爆发,产生局部抗性超敏反应(Hypersensitive response,HR),引起细胞加固及气孔关闭,以提高苹果对外源胁迫的抵御能力。ε-PL也可以诱导抗性物质合成基因和抗氧化酶POD、PPO和谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase,GST)编码基因的上调表达,增强果实的抗病能力。此外,ε-PL可以调节细胞强度相关酶编码基因的表达,来提高苹果细胞壁、角质层强度。在未接种P.expansum情况下,ε-PL诱导苹果果胶水解酶、纤维素水解酶编码基因的下调表达,木质素、角质蜡合成基因的上调表达。而在接种P.expansum情况下,ε-PL可诱导苹果果胶酯酶、纤维素水解酶编码基因的下调表达,木质素、果胶合成酶、角质蜡合成基因的上调表达。(5)ε-PL可以激发苹果的系统获得性抗性(Systematic acquired resistance,SAR),其对苹果抗性诱导依赖于水杨酸(Salicylic acid,SA)途径,且与MAPK级联信号转导密切相关。RNA-seq结果表明,在未接种P.expansum情况下,ε-PL可直接激活SA途径中防御相关基因NPR1、TGA10和PR1的上调表达,启动SAR。在接种P.expansum情况下,ε-PL诱导PAL1基因的上调表达积累SA,进而激发TGA9、TGA4和PR1的上调表达,促进病程相关蛋白(Pathogenesis-related proteins,PRs)在整果范围内的表达,提高果实对青霉病的抗病能力。此外,MAPK级联在ε-PL诱导苹果抗性的信号转导中发挥着枢纽作用,ε-PL可以激活苹果细胞MAPK级联途径来响应外界胁迫及P.expansum的侵染,参与抗病基因的转录激活、植保素(Phytoalexins,PA)的合成、细胞壁加强、HR、ROS迸发、气孔闭合及植物激素信号的转导。(6)ε-PL在苹果体内可抑制P.expansum抗氧化基因、致病基因、能量代谢相关基因及细胞功能和细胞完整性相关基因的表达。ε-PL在苹果体内可有效抑制P.expansum细胞的抗氧化酶编码基因SOD2、CAT、tpc F、hx A、dao1的表达,降低其细胞清除ROS的能力。也可抑制P.expansum细胞壁水解酶(Cell wall degrading enzymes,CWDEs)编码基因pme A、ply A和bgl G的表达,减弱其对细胞壁的降解能力;还使EMP、TCA循环和氧化磷酸化等能量代谢途径的限速酶编码基因下调表达,导致ATP合成量不足,减弱P.expansum对逆境的抵御能力。此外,ε-PL在苹果体内可抑制P.expansum细胞膜脂合成酶、麦角甾醇合成酶和多药物转运蛋白等编码基因的表达,阻碍了分生孢子的分化,破坏了其细胞膜的完整性。(7)基于农杆菌介导转化(Agrobactirium tumfacience mediated-transformant,ATMT)的同源重组技术,成功构建了hx A基因敲除突变株Δhx A和回补株Δhx A-C,并验证了hx A为P.expansum对苹果的关键侵染基因,进一步解释了ε-PL控制苹果采后青霉病与hx A在苹果体内的表达受到抑制有关。利用Cytoscape软件分析P.expansum中与hx A具有互作关系的基因,发现与hx A关联度高的基因共有702个(|Cor|>0.8且P<0.05),而高度关联且下调表达的基因有19个,这些基因与P.expansum的抗氧化能力、侵染力、ATP合成能力及细胞功能和完整性相关。

目的 观察宁心涤痰汤对STAT1/LXR-α信号通路介导的巨噬细胞内质网应激的影响，从而阐明其抑制支架内再狭窄的分子机制。方法 人急性单核细胞白血病细胞（THP-1）体外诱导分化成巨噬细胞后分为空白组、模型组、宁心涤痰汤组和辛伐他汀组。通过ox-LDL诱导构建泡沫细胞模型，并给予相应的药物进行干预。分别采用Western blotting和ELISA法检测各组巨噬细胞STAT1/LXR-α通路与内质网应激相关蛋白的表达水平和炎症因子的含量。构建巨噬细胞与血管平滑肌细胞共培养体系，通过CCK8法和划痕实验检测各组平滑肌细胞增殖和迁移能力的改变。结果 与空白组相比，模型组巨VE-822小鼠噬细genetic exchange胞中p-STAT1、p-PERK、p-elf2α及CHOP蛋白的表达及细胞上清中肿瘤坏死因子-6(IL-6)、人单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量均显著升高，LXR-α蛋白表达显著降低，差异有统计学意义（P <0.01）；与模型组比较，宁心涤痰汤组能够显著抑制巨噬细胞中p-STAT1、p-PERK、p-elf2α及CHOP蛋白的表达和上清中IL-6、MCP-1和TNF-α的含量，上调LXR-α蛋白的表达，差异均有统计学意义（P <0.05或P <0.01）。selleck激酶抑制剂此外，与空白组相比，模型组平滑肌细胞增殖与迁移率显著增加（P <0.01）；与模型组比较，宁心涤痰汤组能够显著抑制平滑肌细胞增殖与迁移率，差异均有统计学意义（P <0.01）。结论 宁心涤痰汤通过促进STAT1/LXR-α通路的活化从而抑制巨噬细胞内质网应激，达到治疗PCI后支架内再狭窄的作用。

特发性肺纤维化（IPF）是一种慢BLZ945化学结构性、进行性、间质性纤维化疾病。白细胞介素-13(IL-13)被认为是一种中央介质，其通过复杂的信号通路，与上皮细胞、selleck巨噬细胞和成纤维细胞等细胞的功能密切相关。IL-13在IPF患者的肺组织中表达上调，可以导致肺泡上皮细胞的分化障碍、促进上皮—间充质转化，并使其产生骨膜蛋白，与其他细胞外基质产生相互作用；而受损的肺泡上皮细胞可以促进IL-13的生成，二者相互作用，形成恶性循环。IL-13作为一种促炎细胞因子，可以通过基质金属蛋白酶、生长分化因子等激活M2型巨噬细胞释放转化生长因子-β等促纤维化分子；而M2型巨噬细胞也可以释放部分抗炎细胞因子减少炎症浸润及损伤修复，从而在IPF发生发展中发挥双重作用。另外，IL-13可以诱导成纤维细胞的活化与增殖，增加其迁移和侵袭性，并促进其向肌成纤维细胞转化，cardiac remodeling biomarkers导致平滑肌细胞收缩以及胶原合成，从而参与IPF的发生发展。

目的:通过采用代谢组学分析,对甲泼尼龙治疗前后的胸腺瘤伴重症肌无力患者的血清代谢物进行检测,寻找关键代谢物与关键通路,再结合网络药理学tumor cell biology分析,对甲泼尼龙的药物靶点进行挖掘,探索甲泼尼龙治疗胸腺瘤伴重症肌无力的作用机制与治疗靶点,从而更好的指导临床用药与治疗。方法:本研究收集了石家庄市人民医院重症肌无力诊疗中心于2021年3月至2022年3月收治的15名胸腺瘤伴重症肌无力患者的血清,通过液相色谱质谱联用技术(Liquid Chromatograph Mass Spectrometer,LC-MS)测定甲泼尼龙治疗前后血清代谢物的含量变化,利用代谢组学数据分析软件Progenesis QI v2.3对得到的原始质谱碎片信息进行整合与解析,并运用单变量分析、多元统计分析等数据分析方法分析组间代谢物差异,筛选差异代谢物的标准是多元统计分析中变量权重值(Variable important in projection,VIP)Pevonedistat化学结构>1且单变量selleck分析中的P值<0.05。差异代谢物筛选完成后将其输入“京都基因与基因组百科全书”数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)进行通路富集分析,寻找关键通路;之后通过网络药理学寻找甲泼尼龙治疗的潜在靶点并联合代谢组学探索甲泼尼龙治疗胸腺瘤伴重症肌无力的作用机制;最后采用酶联免疫吸附实验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,Elisa)对寻找到的关键靶点及关键代谢物的上游合成酶进行验证。结果:1.在代谢组学研究中共筛选出了差异代谢物148个,其中富集到KEGG通路的有25个,上调的有6个,包括溶血磷脂(LysoPC,LyP)、24-羟基胆固醇(24-Hydroxycholesterol)等;下调的有19个,包括神经酰胺(Ceramide,Cer)、鞘磷脂(sphingomyelin,SM)、尿酸(Uric acid)、磷脂酰胆碱(Phosphatidyl cholines,PC)、肉碱(Creatine)、左旋岩藻糖(L-Fucose)等;KEGG通路富集分析显示涉及坏死性凋亡(necroptosis)、C型凝集素受体(C-type Lectins receptor)、胰岛素抵抗(insulin resistance)、甘油磷脂代谢(Glycerophospholipid metabolism)等通路。其中关键代谢物Cer与SM在细胞免疫调节、炎症反应与肿瘤调控中发挥巨大作用。2.网络药理学分析得出肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、类固醇受体共激活因子(Steroid Receptor Coactivator,SRC)等可作为甲泼尼龙治疗胸腺瘤伴重症肌无力的潜在靶点。3.Elisa实验验证结果显示,关键靶点TNF与关键代谢物SM和Cer的上游合成酶在甲泼尼龙治疗后均下调,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.甲泼尼龙可能通过作用于TNF靶点影响坏死性凋亡通路进一步影响鞘磷脂的代谢,导致鞘磷脂与神经酰胺减少来治疗胸腺瘤伴重症肌无力。2.甲泼尼龙在发挥治疗作用的同时可对脂质代谢、糖代谢产生影响从而产生副作用,与既往研究及临床相关表现一致。

小麦是我国重要的粮食作物之一,研究小麦高产群体形成规律对确保我国粮食安全具有重要的作用。通过源库关系来阐明作物产量形成的规律,以探索实现高产的途径。本试验在秸秆全量还田的条件下设置不同的密度与肥料组合来构建不同的产量群体,使用13C和15N同位素示踪法,通过剪叶剪穗的手段研究高产群体中碳氮在植株体内的转运与分配。探究高产群体碳氮代谢途径以及激素对籽粒灌浆调控的过程。为稻茬小麦高产群体的构建和高产群体的调控途径提供理论基础。主要结果如下:1.构建宁麦29高产群体,当密肥组合为:基本苗为150×1PS-34104/hm2和施氮量为330 kg/hm2,基本苗为 225×104/hm2和施氮量为 240kg/hm2或 330kg/hm2,基本苗为 300×104/hm2和施氮量为240kg/hm2,氮肥运筹均为基肥:壮蘖肥:拔节肥:孕穗肥=5:1:2:2时,宁麦29可以实现9000kg/hm2以上产量。实现高产的途径是在稳定有效穗数的基础上,增加每穗粒数和千粒重,进而增强库容。2.高产群体特征表现为:高产群体具有较高的叶面积指数,孕穗期为7.11,开花期为6.05,乳熟期为4.45。花后叶面积指数及高效叶面积率较高。高产群体花后SPAD值较高且从开花期到乳熟期SPAD值下降率较低,花后叶片持绿时间较长。高产群体总结实粒数高,具有较高的粒叶比。光合特征表现为:高产群体花后具有较高的剑叶净光合速率,群体对光能的利用率较高。高产群体间冠层透光率较低,漏光损失少。3.高产群体对光能的利用率更高,从13C同位素示踪法可以看出,高产群体茎、叶、穗的碳分cutaneous nematode infection配率更高。叶片中的蔗糖磷酸合成酶与可溶性糖含量成正比,叶片中可溶性糖的含量决定着源端对库端确认细节的供应能力,高产群体中叶片的光合同化物更多的转运到籽粒中。在籽粒灌浆期间,生长素的含量与碳水化合物的含量成正比,高产群体中籽粒的生长素含量较高,蔗糖合成酶活性较高,调控着蔗糖的合成,淀粉合成底物充足。赤霉素含量与淀粉含量成反比,高产群体籽粒赤霉素含量较低,抑制籽粒中的淀粉酶的水解,籽粒中生长素与赤霉素共同调控籽粒淀粉的合成导致高产群体籽粒千粒重增加。4.高产群体氮素吸收利用率高,从15N同位素示踪可以看出,高产群体各器官对15N标记尿素的吸收量高于其余产量群体,茎、叶、穗对氮素的吸收利用率也更高。高产群体叶片中的谷氨酰胺合成酶、硝酸还原酶、谷氨酸合成酶活性高,植株吸收的无机氮在这些高活性的氮代谢酶的作用下更好的转化为氨基酸运输到籽粒中,籽粒对氮素的利用率增加,提高小麦产量。5、高产群体的源库调控途径:1、确定合理的基本苗数。在确定合理的基本苗的基础上通过增加穗粒数和千粒重来提高产量。2、延长花后源的光合能力。延长叶源的持绿时期可以增加源的光合同化能力从而获得较高的花后干物质积累量。3、协调源库比。在保证适宜的基本苗的基础上,适当减少无效叶源,提高库源比,提高群体的通风透光条件,发挥上三叶最大的光合同化能力。

本试验旨在研究日粮中添加藤茶提取物对育肥猪肉品质的影响。选用平均初始体重为60 kg的三元杂交（杜×长×大）猪135头，随机分成3个处理组，分别为对照组（饲喂基础日粮）、试验Ⅰ组（基础日粮中添加0.03%藤茶提取物）、试验Ⅱ组（基础日粮中添加0.06%藤茶提取物），每组5个栏，每栏9头猪。正式试验2个月后，试验猪出栏称重，每栏挑选最接近该栏平均体重reuse of medicines的猪进行屠宰，取样。结果表明：3组间背最长肌的肉色、pH、滴水损失、肌内脂肪和剪切力均无显著差异（P>0.05）；对照组与试验Ⅰ组、Ⅱ组的丝氨酸含量差异显著（P<0.05），且对照组均高于试验组（P<0.05）;3组间肌苷酸含量均差异显著（P<0.05），以试验Ⅰ组的肌苷酸含量最高，对Crizotinib化学结构照组次之AG-221（P>0.05）。综上所述，育肥猪饲料中添加0.03%藤茶提取物可改善猪肉品质。

目的 了解赤道几内亚Bioko岛恶性疟原虫分离株青蒿素耐药相关基因Pfubp1和Pfap2mu的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)流行情况,为该地区疟疾防治方案的制定提供基线数据。方法 采集2018—2020年赤道几内亚Bioko岛恶性疟患者临床血样184份,提取血样中恶性疟原虫基因组DNA。采用巢式PCR技术和Sanger测序法检测恶性疟原虫Pfubp1和PfapEntinostat临床试验2mu基因,并对基因序列进行比对分析。结果 赤道几内亚Bioko岛分离株恶性疟原虫Pfubp1基因中,无突变虫株占88.83%(159/179)。20株突变虫株(11.17%,20/179)共分离出6个不同SNPs,该6个SNPs有4个非同义突变,分别为E1516G、K1520E、D1525E、E1528D;95.00%(19/20)antibiotic-loaded bone cement的突变分离株中仅有1个基因突变位点,其中非同义突变占68.42%(13/19)。与以青蒿素为基础的联合疗法(artemisinin-based combination therapies,ACTs)耐药相关的PfuNN2211作用bp1基因中,D1525E和E1528D为已知主要流行突变位点;在第1525位点氨基酸,野生型虫株占99.44%(178/179)、突变型虫株占0.56%(1/179),该突变位点仅在2018年采集的样本中发现;在第1528位点,野生型虫株占93.30%(167/179)、突变型虫株占6.70%(12/179)。在Pfap2mu基因3个区域(Pfap2mu-inner1、Pfap2mu-inner2、Pfap2mu-inner3)的目标扩增片段中,野生型虫株所占比例分别为95.72%(134/140)、79.25%(126/159)和95.83%(161/168);在所有测序成功的样本中筛出16个不同SNPs,共有7个非同义突变,分别为S160N、K199T、A475V、S508G、I511M、L595F、Y603H;43株突变分离株中,有1个以上突变位点的占16.28%(7/43),其中非同义突变占28.57%(2/7)。与ACTs相关的已知延迟清除位点为S160N,野生型虫株占89.94%(143/159)、突变型虫株占10.06%(16/159)。结论 赤道几内亚Bioko岛恶性疟原虫Pfubp1和Pfap2mu基因均发生不同水平突变,Pfubp1基因突变型比例低、Pfap2mu基因突变型比例较高,本研究还发现了Pfubp1 E1504E、K1520E和Pfap2mu A475V、S508G等新位点。

类风湿性关节炎是一种常见的自身免疫性疾病,其特征为持续性滑膜炎并伴随剧烈疼痛,严重者导致功能损害和残疾。患者体内表现为免疫细胞的浸润和多种促炎细胞因子的表达。肿瘤坏死因子α(TNF-α)是由157个氨基酸残基组成的三聚体可溶性NVP-TNKS656蛋白,位于多种促炎因子的顶端,是免疫调节的中枢因子,实现炎症的启动和维持,在类风湿性关节炎的发病机制中占主导地位,是治疗类风湿性关节炎的重要治疗靶点。研究表明,饮用绿茶有利于遏制自身免疫性疾病的发生发展。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是绿茶中含量最丰富和活性最强的小分子化合物,具有显著的抗氧化和抗炎特性,已被证明能够改善类风湿性关节炎的症状。然而,EGCG以TNF-α为治疗靶点与其相互作用改善类风湿性关节炎的研究尚不深入。因此,本研究拟通过对重组TNF-α蛋白进行表达与纯化,获得高纯的TNF-α蛋白,进而探究EGCG与TNF-α蛋白的相互作用来改善类风湿性关节炎的作用机制。实验室前期已成功构建了表达TNF-α的表达质粒(p ET28-TNF-6His)。本研究首先将该重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中并进行目的蛋白的表达;优化目标蛋白的表达条件;在通过亲和层析等纯化技术,得到了高纯度的重组TNF-α蛋白。在此基础上,采用表面等离子共振(SPR)技术检测EGCG与TNF-α/TNFR1/TNFR2之间相互作用关系,通过L929细胞和293-NF-κB报告细胞,采用细胞毒性实验分析、荧光素酶报告基因方法分析,探究EGCG对TNF-α活性的影响。选用类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞RA-HFLS为细胞模型,采用MTT和蛋白免疫印迹(Western Blot)方法探究EGCG对RA-HFLS细胞中TNF-α介导的NRoxadustat纯度F-κB信号通路活化和细胞增殖的影响。主要研究结果如下:(1)琼脂糖凝胶电泳结果显示,p ET28-TNF-6His质粒成功转Cell Biology化到大肠杆菌BL21(DE3)中;(2)SDS-PAGE电泳结果显示,大肠杆菌BL21(DE3)能成功表达出TNF-α蛋白;(3)为了优化重组蛋白TNF-α的诱导表达条件,对诱导剂种类、诱导剂浓度、诱导温度和诱导时间四个方面进行探究。最优表达条件为0.1 m M IPTG为诱导剂、28℃诱导12 h;(4)通过Ni-NTA亲和层析柱使蛋白分离纯化,成功纯化出浓度为1.62μg/μL、纯度高达96%的重组TNF-α蛋白;(5)在分子互作水平上,EGCG能够同TNF-α、TNFR1和TNFR2直接结合,具备相似的浓度亲和力,进而阻断TNF-α与其受体TNFR1、TNFR2之间的结合;(6)EGCG能够显著抑制TNF-α诱导的L929细胞凋亡,并且这种作用不是由于细胞毒性产生的;(7)EGCG可抑制293-NF-κB报告细胞中TNF-α诱导的NF-κB信号通路的活化;(8)EGCG能够抑制RA-HFLS细胞中TNF-α介导的NF-κB信号通路,遏制相关标志蛋白(IKKα/β、IκBα、P65)的活化。综上所述,本研究通过重组蛋白的表达与纯化技术,成功得到TNF-α重组蛋白。发现EGCG能同TNF-α蛋白及其受体直接结合,破坏TNF-α同TNFR1与TNFR2之间的相互作用,抑制TNF-α诱导的NF-κB信号通路在RA-HFLS细胞中活化,进而遏制了炎症的过度活化,从而改善类风湿性关节炎的发生发展。因此,日常饮用绿茶中EGCG可能是预防性治疗TNF-α相关炎症疾病的潜在保健食品。

近二十年,肺癌的诊疗取得了显著进展,但仍有较多患者因为现有诊断方法的灵敏性和特异性不足等缺陷,确诊较晚得不到及时治疗而死亡。因此,为提高肺癌临床诊断的灵敏性和特异性,迫切需要探索现有诊断方法的潜在机制,以期为肺癌患者的诊疗作出进一步的贡献。在人类和小鼠的研究中EpCAM被用作肿瘤细胞鉴定和分离的标记物,但经常表现出敏感度低此网站和特异性差的缺点。为了解决这个问题,本文结合公共数据库并采用WB、FACS、RT-PCR等实验方法,从基因调控和表Latent tuberculosis infection观遗传修饰水平对人和小鼠EpCAM在原发性和转移性肺癌的表达进行了系统性PF-03084014核磁的分析和比较,此外,我们还研究了巨噬细胞和TGFβ对肿瘤细胞EpCAM表达的影响。本文发现在转录因子和表观遗传修饰的调控下,EpCAM在原发性和转移性肺癌中呈现出不同的动态表达模式。在原发性肺癌中,EpCAM的表达上调是由epcam基因扩增和启动子低甲基化导致的,在临床中可作为诊断的生物标记物。在转移性肺癌中,EpCAM下调表达的原因包括肿瘤微环境中巨噬细胞分泌的TGFβ,而表观遗传药物DNMT抑制剂5-aza-d C和HDAC抑制剂MS-275可以重新激活EpCAM的表达。本文的发现为后续EpCAM作为生物标志物在肺癌不同临床阶段的检测和肿瘤细胞的分离提供了新的指导方针和理论基础。