PI3K抑制剂

肿瘤坏死因子(TNF)SAHA配制相关凋亡诱导配体(TRAIL)是TNF超家族的一员。TRAIL能够通过与受体(TRAILR)结合选择性诱导肿瘤细胞的凋亡,并且几乎不存在全身毒性。因此,在寻找理想的肿瘤治疗药物的过程中,TRAIL迅速引起人们的兴趣。目前已开发出多种针对TRAIL-TRAILR的候选抗肿瘤药物,其中多个重组可溶性TRAIL蛋白药物已进入临床试验阶段。遗憾的是,临床实验中并没有显示出显著的抗肿瘤活性,导致失败的原因,包括耐药性、脱靶毒性、半衰期短等。为了解决这些弊端,研究人员通过生物工程获得更稳定的三聚体形式重组TRAIL,利用纳米材料进行靶向递送,以及利用载体表达TRAIL基因进行基因治疗等,但尚未进一步推动TRAIL的临床应用。TRAIL除了能特异性诱导肿瘤细胞凋亡外,对炎症和自身免疫模型的研究表明,TRAIL可以通过许多不同的方式影响免疫细胞。虽然TRAIL最初被发现是在自然杀伤(NK)细胞或细胞毒性T细胞的肿瘤防御中具有重要作用,但TRAIL对调节性T细胞(Tregs)、效应T细胞、中性粒细胞和抗原提呈细胞的附加作用也成为人们关注的焦点。尽管目前已有一些研究报道了重组TRAIL能够通过诱导Tregs等免疫细胞凋亡影响肿瘤免疫微环境,但其在肿瘤微环境(TME)中潜在的调节作用和机制尚不清楚。研究重组TRAIL在TME中的免疫调节作用和机制可能会提供一个重要的视角去理解重组TRAIL的临床耐药,并有助于探索更有效的肿瘤治疗策略。由于人源TRAILR和鼠源TRAILR存在结构差异,人源TRAIL对鼠源TRAILR的亲和力较弱,为了能够更好的在免疫全能鼠中评价重组TRAIL在肿瘤免疫微环境中的调节作用和机制,本论文首先构建并纯化得到可溶性鼠源TRAIL(sm TRAIL)用于鼠源系统中的评价。在体外,通过细胞杀伤实验确定了鼠乳腺癌细胞4T1为sm TRAIL的敏感细胞系,结直肠癌细胞CT26和黑色素瘤细胞B16为sm TRAIL的非敏感细胞系。以上述三种细胞在免疫全能小鼠中建立肿瘤模型,参考TRAIL临床试验中的治疗浓度,选择0.5 mg/kg、2 mg/kg、8 mg/kg sm TRAIL三种剂量进行治疗。但值得注意的是,肿瘤治疗效果并未呈现剂量依赖,2 mg/kg sm TRAIL治疗组不管是敏感细胞系还是非敏感细胞系中都展现出最好的肿瘤治疗效果;而8 mg/kg sm TRAIL组治疗效果较差甚至表现出促肿瘤生长的作用。通过免疫组化对肿瘤组织内caspase检测可知,不同剂量的sm TRAIL能够诱导4T1细胞的凋亡但诱导CT26和B16细胞的凋亡能力较弱,这说明在肿瘤治疗过程中,除了凋亡作用还存在其它因素(如免疫调节)影响了sm TRAIL在体内的抗肿瘤效应。接下来,我们选择sm TRAIL敏感细胞4T1及非敏感细胞CT26作为研究模型,通过流式细胞术对小鼠肿瘤组织中的免疫细胞进行分析,检测发现:2 mg/kg sm TRAIL可激活先天性免疫细胞和CD8~+T细胞;而8 mg/kg sm TRAIL会抑制NK细胞和CD8~+T细胞的活化,并显著增加M2样巨噬细胞的浸润数量。同时,我们分别对4T1和CT26小鼠肿瘤模型的肿瘤进行转录组测序及单细胞RNA测序,测序得到的结论与流式检测的结果相一致,进一步印证不同剂量sm TRAIL对瘤内的免疫细胞会产生不同的调节作用,进而影响肿瘤生长情况。我们还分别在蛋白水平以及转录水平对两种肿瘤模型瘤内的细胞因子表达进行了检测,结果显示:2mg/kg sm TRAIL可促进IL-12、IFN-γ的表达,8 mg/kg sm TRAIL会使IL-10、VEGF的表达增高。结合免疫细胞浸润和激活结果可知,2 mg/kg sm TRAIL治疗有利于免疫激活,实现肿瘤杀伤;而8 mg/kg sm TRAIL组则促进免疫抑制微环境的生成,抵消sm TRAIL对肿瘤细胞的凋亡作用。随后,我们着重探究了8 mg/kg sm TRAIL治疗引发免疫抑制的机制。首先,通过体内体外实验验证了sm TRAIL对NK细胞的抑制作用,结果发现,NK细胞在sm TRAIL的肿瘤治疗中至关重要,但NK细胞的活化受到抑制并不是sm TRAIL直接作用于NK细胞导致。随后,我们对sm TRAIL对肿瘤细胞的影响进行了探究,结medical demography果显示,sm TRAIL通过TRAIL-TRAILR轴可以诱导肿瘤细胞分泌CCL2,阻断TRAIL-TRAILR轴可以有效控制瘤内CCL2的分泌,并抑制肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的招募,进而使得8 mg/kg sm TRAIL组显著抑制肿瘤的生长。单细胞RNA测序等结果也表明,8 mg/kg sm TRAIL治疗可促进M2样巨噬细胞的募集。此外,我们还发现sm TRAIL对巨噬细胞也会产生直接作用促进M2样巨噬细胞的极化。sm TRAIL与巨噬细胞表面的TRAILR结合后,使得胞内Fox O1表达增多,Fox O1与IL-10启动子结合,促进IL-10的分泌。对8 mg/kg sm TRAIL治疗引发的免疫抑制机制进行总结:sm TRAIL与肿瘤细胞的TRAILR结合后,诱导肿瘤细胞分泌CCL2,CCL2对CCR2~+TAMs进行招募;同时sm TRAIL还可以直接作用于TAMs,促进M2样TAMs的极化以及IL-10的分泌,进一步促进免疫抑制微环境的形成,从而抑制了肿瘤微环境中NK细胞和CD8~+T细胞的激活和功能。最后,我们在免疫系统人源化小鼠模型(HU-HSC-NPG.GM3)中评价了重组可溶性人源TRAIL(sh TRAIL)的抗肿瘤效果及免疫调节作用,结果显示,2mg/kg和8 mg/kg sh TRAIL都能显著抑制人结直肠癌细胞HCT116的生长,而8mg/kg sh TRAIL会使得瘤内Tregs和M2样巨噬细胞的数量增多,导致其与2 mg/kg sh TRAIL治疗组相比没有更好的治疗效果。sh TRAIL在TME中的调节作用与sm TRAIL的作用相似,都是通过增加瘤内的M2样巨噬细胞而产生免疫抑制作用,为解除这种免疫抑制,我们将sh TRAIL与巨噬细胞靶向药物曲贝替丁(trabectedin)进行联合用药。联合治疗组能够显著提升淋巴细胞及激活的CD8~+T细胞的浸润,显著减少瘤内Tregs和M2样巨噬细胞的数量,重塑了肿瘤免疫微环境,增强了瘤内抗肿瘤免疫作用,提升了sh TRAIL的抗肿瘤效果。综上所述,本论文在不同小鼠肿瘤模型中全面地评估了sm TRAIL的抗肿瘤效果以及对瘤内多种免疫细胞的影响,发现sm TRAIL在免疫功能正常的小鼠肿瘤模型中具有与剂量相关的免疫调节作用,并对其在肿瘤微环境中的免疫调节机制进行了探究。同时,在人源化小鼠肿瘤模型中使用sh TRAIL验证了其抗肿瘤效果及其免疫调节作用,并通过联合化药进一步放大抗肿瘤效应及激活机体抗肿瘤免疫。论文关于重组TRAIL在肿瘤微环境中免疫调节机制的探究,为TRAIL的进一步临床应用提供了重要基础和依据,并对TRABLZ945细胞培养IL与化药及免疫治疗药物的联合治疗策略优化具有一定的指导意义。

目的 探讨颞叶内侧癫痫伴抑郁（MTLEWD）病人在静息态功能磁共振成像（rs-fMRI）中功能活动异常的脑区的特点。方法 纳入2021年1—12月在海南医学院第一附属医院神经内科门诊符合国际抗癫痫联盟（ILAE）诊断分类标准的颞叶内侧癫痫病人，根据HAMD评分将病人分为MTLEWD组和颞叶内侧癫痫不伴抑郁组（MTLE组），同时纳入与病人性别、年龄相匹配的对照组。使用GE Discovery MR7503.0T设备根据预先设定参数行磁共振扫描，获取静息态功能磁共振数据。采用SPSS 22.0统计MC3说明书分析软件对一般人口学资料进行分析。基于MATLAB 2018平台采用DPABI软件对磁共振数据进行预处理，使用功能连接密度（FCD）分析指标对三组被试者行ANOVA分析差异有统计学意义的脑区，然后行组间两样本的t检验，根据高斯随机场（GRF）理论满足体素显著性<0.001、连续体素数量≥23，团块显著性<0.05的区域被认为差异有统计学意义。结果 共纳入MTLE组病人20例，MTLEWD组病人21例，对照组25例，三urinary infection组病人一般资料（年龄、性别）差异无统计学意义（P>0.05）。三组的FCD值差异的脑区主要在楔前叶、颞中回、颞下回、左侧小脑cruse1区、左侧小脑cruse2区、左侧小脑7b区AM-2282溶解度、左侧小脑8区、额中回、左侧颞极（颞上回）、颞极（颞中回）等脑区。结论 MTLEWD病人活动异常脑区主要集中在默认网络相关脑区及小脑，上述脑区功能紊乱与病人的抑郁症状相关；使用Rs-fMRI分析方法能够客观地对病人进行功能评价。

目的:探究艾普拉唑钠对消化性溃疡出血患者的治疗效果。方法:按随机数字表法将我院2020年10月—2021年10月收治的86例消化性溃疡出血患者分为两组。对照组(nselleck HPLC=43)予以奥美拉唑钠治疗，研究组(n=43)加用艾普拉唑钠治疗，对比两组临床疗效、症状缓解时间、胃蛋白酶原(PG)[血清蛋白酶血清胃蛋白酶原Ⅰ(PGⅠ)、胃蛋白酶原Ⅱ(PGⅡGSK J4分子量)、PGⅠ/PGⅡ比值(PGR)]及胃泌素[胃泌素-17(G-17)]、止血成功率、再出血率和不良反应。结果:研究组治疗后临床疗效、止血成功率均高于对照组，再出血率低于对照组，症状缓解时间短于biomass additives对照组，研究组治疗后PGⅠ、PGⅡ、G-17水平低于对照组，研究组治疗后PGR水平高于对照组(P<0.05);两组不良反应对比，无统计学差异(P>0.05)。结论:艾普拉唑钠治疗消化性溃疡出血患者疗效显著，可有效改善PG及G-17水平，患者预后良好，安全可靠，值得临床推广应用。

目的 探讨瓜石汤联合丹参片治疗玫瑰痤疮的疗效及安全性。方法 选取2021年6月-2023年6月期间在庆阳市中医医院收治的Tamoxifen溶解度辩证属阴虚内热兼血瘀的玫瑰痤疮患者90例，按治疗方案的不同分为对照组和观察组，各45例。对照组给予常规药物治疗（外用甲硝唑凝胶+口服多西环素胶囊），研究组在常规用药的基础上给予瓜石汤联合丹参片治疗，均治疗8周。观察两组患者的治疗有效率、主观和客观症状评分、皮肤屏障功能评分、玫瑰痤疮生活质量量表（RosaQoL）评分及不良反应发生情况。结果 研究组治疗总有效率为93.33%，整体疗效显著优于对照组（P <0.05）；治疗后，两组主观症状总分和各客观皮损症状（潮红、红斑、毛细血管扩张、丘疹脓疱）评分均显著降低，且研究组的主观症状总分和各客观皮损症状评分均低于对照组（P <0.05）；治疗后，两组的经皮水分流失量(TEWL)均显著降低，角质层含水量显著升高（P <0.05）；治疗后研究组的TEWL低于对照组，角质层含水量高于对照组（P <0.05）；治疗后，两组RosaQoL的各维度得分及总分均显著降低，且研GSK J4价格究组的RosaQoL各维度得分及总分均低于对照组（P <0.05）；两组不良反应无显著性差异（P> 0.05）。结论 瓜石汤联合丹参片治疗属阴虚内热兼血瘀的玫瑰痤疮疗效佳，可明Mediterranean and middle-eastern cuisine显缓解患者的症状和改善皮肤状态，并提高生活质量，安全性高。

目的：探讨异槲皮素（I S O）对巨噬细胞极化表型的影响及相关分子机制。方法：体外培养RAW264.7、THP-1细胞株，采用CCK-8法检测ISO作用后巨噬细胞活力。根据CCK-8结果设置低、中、高hepatic protective effects剂量ISO组，采用Western Blot、RT-qPCR、流式细胞术检测ISO对M0及M2型巨噬细胞中M2型标志物及Yes相关蛋白（YAP）表达水平的影响。此外，加入YAP抑制剂，检测其对巨噬细胞极化表型的影响。结果：在M0及M2巨噬细胞模型中，selleck抑制剂ISO作用巨噬细胞24 h后，细胞中M2型标志物甘露糖受体（CD206）及YAP表达量增加（P<0.05,P<0.01）。流式细胞术也证实ISO作用后巨噬细胞中CD206平均荧光强度（MFI）显著升高（P<0.05,PF-6463922P<0.01）。此外，YAP抑制剂能减弱ISO上调巨噬细胞CD206表达（P<0.01）。结论：异槲皮素作为免疫调节剂，可以通过激活YAP从而促进巨噬细胞抗炎M2表型的极化。

采用EMS诱变野生型高粱BTx623种子的方法获得紫色叶突变体。以野生型BTx623为对照，进行成熟期农艺性状调查和苗期生理生化指标测定。结果表HDAC抑制剂明，sbsn1与BTx623相比，穗长、穗柄长、株高、粒数、千粒重、和穗宽均极显著降低，茎粗和节数极显著增加，突变体sbsn1的粒数降低到BTx623的1/2，抽穗期延后了20～30 d。缺氮条件下苗期叶片叶绿素测定结果显示，突变体sbsn1叶绿素降低幅度cysteine biosynthesis大于BTx623，初步推断出缺氮可能导致依赖光的光合作用能力减弱、使叶片中的叶绿素含量降低；突变体sbsn1叶片花青素含量、可溶性糖及总淀粉含量在缺氮条件下极显著高于BTx623。说明突变体sbsn1具有较强的抵抗缺氮逆境能LEE011力以维持自身正常生长。高粱作为C4植物，光合效率高，耐瘠薄，养分和水分利用效率是C3作物的2倍，但是对高粱养分吸收利用机制研究较少，本研究通过对高粱氮缺乏条件下根伸长不敏感突变体sbsn1，进行农艺性状以及苗期理化特性的测定，为下一步新基因定位以及基因功能的研究提供重要依据。

【目的】探讨2019年云南省瑞丽市登革病毒血清型及基因型特点,为当地制定有效的登革热防控策略和措施提供依据。【方法】收集2019年瑞丽市Alisertib体内登革热(Dengue fever,DF)患者急性期血清标本,并储存于云南省寄生虫病防治所资源库-80℃冰箱。采用Axy Prep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒提取DF患者急性期血清中登革病毒(Dengue virus,DENV)RNA,采用实时荧光定量PCR法(Quantitative Real Time PCR,q PCR)对DENV核酸检测和血清型鉴定,DENV核酸检测阳性标本血清接种至Vero细胞进行病毒分离培养,提取盲传三代后DENV毒株RNA,经逆转录-聚合酶链式反应法(Reverse transcription PCR,RT-PCR)扩增和琼脂糖凝胶电泳后,切胶回收纯化,将纯化DNA送至生工生物工程股份有限公司(昆明)进行双向测序。在GenMultiplex Immunoassays Bank中检索并下载全球不同年代和不同流行地区的参考序列,使用Snap Gene、Seq Man、Editseq、MEGA X和Megalign等生物学软件进行E基因序列拼接、DENV系统进化树及其核苷酸相似性(氨基酸同源性)分析。采用Excel 2019对瑞丽市2019年DENV数据和相关资料进行分析处理。【结果】共对瑞丽市2019年瑞丽市1000份疑似DF病例急性期血清标本进行DENV核酸检测,其中18份呈阳性,阳性率为1.8%(18/1000);共检测出3种DENV血清型,其中DENV-Ⅰ型2份(11.11%,2/18),DENV-Ⅱ型1份(5.56%,1/18),DENV-Ⅲ型15份(83.33%,15/18),未检测到DENV-Ⅳ型。盲传三代后分离培养出DENV-Ⅰ型毒株2株、DENV-Ⅱ型毒株1株、DENV-Ⅲ型毒株5株;其中扩增出6株毒株E基因目标片,包括DENV-Ⅰ型2株(33.33%,2/6),DENV-Ⅱ型1株(16.67%,1/6),DENV-Ⅲ型3株(50%,3/6)。从系统发育显示,2株DENV-Ⅰ型属于基因型Ⅰ型(Genotype I,G-I),1株DENV-Ⅱ型属于基因型AsianⅠ型,2株DENV-Ⅲ型属于基因型Ⅰ型(Genotype I,G-I)和1株DENV-Ⅲ型属于基因型Ⅲ型(GenotypeⅢ,G-Ⅲ)。对DENV E基因核苷酸相似性分析发现,2株DENV-Ⅰ型E基因核苷酸相似性为98.3%(96.6%),与2019年泰国株(MZ619040)同在一小支,核苷酸相似寻找更多性为97.5%～98.2%,与1945年DENV-Ⅰ原型株(AF425619)核苷酸相似性为92.3%～93.2%;1株DENV-Ⅱ型单独在一个亚分支,与2019年缅甸株(MW788983)、2018年缅甸株(MW788982、MW788981)核苷酸相似性分别为99.7%和99.6%,与1944年DENV-Ⅱ原型毒株(AB609589)核苷酸相似性仅为93.9%;3株DENV-Ⅲ型E基因核苷酸相似性为90.6%～99.6%,其中RL01、RL17株核苷酸相似性高达99.6%;RL01株与2018年缅甸株(MW788903)同在一小分支,核苷酸相似性高达99.8%,RL17株单独在一个亚分支上,与2019年缅甸株(MW788899)、2018年缅甸株(MW788912、MW788903)、2017年缅甸株(MW788879)核苷酸相似性高达99.7%,RL04株与2018年缅甸株(MW788907、MW788911)、2017年缅甸株(MW788887)同在一分支,核苷酸相似性高达99.5%～99.7%,与1956年DENV-Ⅲ原型株H87株(AB609590)核苷酸相似性为92.3%～93.1%。【结论】2019年云南省瑞丽市主要存在3种DENV血清型和4种基因型,即DENV-Ⅰ型G-Ⅰ型、DENV-Ⅱ型AsianⅠ型、DENV-Ⅲ型G-Ⅰ型、DENV-Ⅲ型G-Ⅲ型;其中DENV-Ⅲ基因G-Ⅲ型为瑞丽首次发现;DENV-Ⅰ型毒株可能源于泰国输入,DENV-Ⅱ型毒株和DENV-Ⅲ型毒株可能源于缅甸输入,建议相关部门加强DENV基因型监测。

干旱对农gibberellin biosynthesis业生产和人类活动造成了严重威胁,在过去十年中,由于干旱造成的全球作物生产损失已经增加到约300亿美元。随着全球人口的增加,对水的需求也将增加。我国降雨在地理分布上呈现南多北少,东多西少的常态,北方地区长期面临着土壤干旱的巨大挑战,干旱面积占全国耕地总面积的一半以上。因此,阐明植物抗旱的分子机制和发掘植物的抗旱调控网络是现代农业发展的一个重大挑战,对农业可持续发展至关重要。植物激素脱落酸(Abscisic acid,ABA)作为重要的逆境激素,是植物应对逆境的重要调节激素之一。植物体内的ABA由ABA受体Pyrabactin resistance 1(PYR1)和PYRPUN30119临床试验1-like(PYL)proteins(PYLs)所感知,并由其启动下游信号调控网络。ABA受体的转录后调控是激活ABA信号的重要因素,已经成为众多研究的主题。钙离子(Ca~(2+))是真核生物中常见的第二信使之一,一直是植物细胞信号转导的难点和热点。外界刺激所产生的Ca~(2+)信号由Ca~(2+)感受器所感知,钙调素磷酸酶B亚基蛋白Calcineurin B-like proteins(CBLs)及其互作蛋白激酶CBL-Interacting protein kinases(CIPKs)作为一类重要的Ca~(2+)感受器,广泛参与调控植物生长发育与逆境胁迫等过程。在干旱胁迫下,ABA通过环核苷酸门控通道Cyclic nucleotide gated channels(CNGCs)介导的胞质Ca~(2+)的震荡在植物响应干旱中同样发挥着重要作用。然而,目前还没有研究明确Ca~(2+)信号是否可以反馈调节ABA信号传导。本文通过一系列的生理学和细胞生物学实验发现,Ca~(2+)感受器CBL1/9-CIPK1通过磷酸化修饰ABA受体PYLs负向调控ABA信号与干旱胁迫响应。此外,研究结果解决了一个长期存在的争议,即虽然CBL1/9-CIPK23复合物激活了S型阴离子通道(Slow anion channel-associated 1)SLAC1,但cbl1/9和cipk23突变体表现出耐旱表型。本研究表明,cbl1/9的耐旱表型是负调控ABA受体的造成的。CBL1/9-CIPK可能优先调节ABA受体的活性来负向调节干旱胁迫。以上研究表明,CBL1/9-CIPK1对PYLs活性的负调控是植物优化生长和响应干旱胁迫的一个关键机制。论文的主要结果如下:1.由于cipk1突变体在Ws背景中已经报道对外源ABA敏感,基于不同生态型之间植物表型可能具有差异,首先采用反向遗传学手段发现在Col背景下,CIPK1基因的突变同样会导致拟南芥对ABA敏感。通过表达CIPK1启Dinaciclib小鼠动子驱动的GUS发现CIPK1在气孔中具有高表达,进一步通过土壤干旱以及气孔开度测量等实验证实了CIPK1可能是拟南芥响应ABA信号和干旱胁迫的一个负调控因子。同时对与CIPK1互作的CBL1/9加以研究,发现CBL1/9-CIPK1复合体参与负向调控ABA信号及干旱胁迫响应。2.通过酵母双杂交实验发现CIPK1与ABA受体存在互作可能,随后的双分子荧光互补(Bi FC)实验发现CIPK1与PYLs之间的互作在细胞核、细胞质以及细胞膜上均存在。使用分裂荧光素酶互补(LCI)实验,体外Pull-down实验以及Co-IP实验进一步证实了CIPK1与ABA受体PYR1/PYL1/PYL2/PYL3/PYL4/PYL5/PYL6之间的物理相互作用。此外,利用烟草叶肉细胞原生质体观察到在表达CBL1时,CIPK1与PYLs的互作仅发生在质膜上。3.利用体外磷酸化实验发现CIPK1能够在PYL4保守的Ser129位点磷酸化修饰PYLs以调控PYLs的活性。利用体外重组ABA信号通路以及体外磷酸酶活性等实验发现CIPK1磷酸化修饰的PYLs是无活性的,在存在ABA的条件下不能抑制ABI1的磷酸酶活性。酵母双杂交以及体外Pull-down实验表明磷酸化影响了PYLs与ABI1的互作。同时对磷酸化的PYL4进行了体内分析,结果表明磷酸化不改变PYL4的定位,仅导致PYL4的失活,PYL4和PYL4~(S129A)植物恢复了ABA受体五突变体pyr1pyl2458(12458)对ABA的耐受性和干旱敏感性,同时恢复了生长缺陷表型,而模拟磷酸化的PYL4~(S129D)植物则表现出与12458植物相似的表型。综合体内体外实验结果,说明CIPK1磷酸化的PYLs是无活性的PYLs。4.利用LCI实验发现Sn RK2.6不与CIPK1互作,不参与CIPK1对ABA受体的调节过程。其次通过外源添加ABA发现,使用Co-IP实验以及磷酸化实验证实ABA直接影响CIPK1与PYLs之间的物理互作,进而影响CIPK1对PYLs的磷酸化。最后通过构建12458/cipk1突变体进行遗传学实验表明CIPK1位于PYLs上游磷酸化PYLs发挥功能。基于上述研究内容提出了Ca~(2+)信号负向调节ABA信号的新机制。在正常条件下,Ca~(2+)感受器CBL1/9-CIPK1通过在保守的PYL4~(S129)磷酸化ABA受体PYLs负向调控ABA信号,保证植物的正常生长发育;在干旱胁迫下,ABA直接抑制CIPK1与PYLs之间的互作,有活性的ABA受体传递干旱信号,保障植物渡过干旱逆境。这种Ca~(2+)信号对ABA信号的反馈调节机制在植物平衡生长与适应环境中发挥着重要作用,研究成果为作物抗旱育种奠定了理论基础。

干旱对农gibberellin biosynthesis业生产和人类活动造成了严重威胁,在过去十年中,由于干旱造成的全球作物生产损失已经增加到约300亿美元。随着全球人口的增加,对水的需求也将增加。我国降雨在地理分布上呈现南多北少,东多西少的常态,北方地区长期面临着土壤干旱的巨大挑战,干旱面积占全国耕地总面积的一半以上。因此,阐明植物抗旱的分子机制和发掘植物的抗旱调控网络是现代农业发展的一个重大挑战,对农业可持续发展至关重要。植物激素脱落酸(Abscisic acid,ABA)作为重要的逆境激素,是植物应对逆境的重要调节激素之一。植物体内的ABA由ABA受体Pyrabactin resistance 1(PYR1)和PYRPUN30119临床试验1-like(PYL)proteins(PYLs)所感知,并由其启动下游信号调控网络。ABA受体的转录后调控是激活ABA信号的重要因素,已经成为众多研究的主题。钙离子(Ca~(2+))是真核生物中常见的第二信使之一,一直是植物细胞信号转导的难点和热点。外界刺激所产生的Ca~(2+)信号由Ca~(2+)感受器所感知,钙调素磷酸酶B亚基蛋白Calcineurin B-like proteins(CBLs)及其互作蛋白激酶CBL-Interacting protein kinases(CIPKs)作为一类重要的Ca~(2+)感受器,广泛参与调控植物生长发育与逆境胁迫等过程。在干旱胁迫下,ABA通过环核苷酸门控通道Cyclic nucleotide gated channels(CNGCs)介导的胞质Ca~(2+)的震荡在植物响应干旱中同样发挥着重要作用。然而,目前还没有研究明确Ca~(2+)信号是否可以反馈调节ABA信号传导。本文通过一系列的生理学和细胞生物学实验发现,Ca~(2+)感受器CBL1/9-CIPK1通过磷酸化修饰ABA受体PYLs负向调控ABA信号与干旱胁迫响应。此外,研究结果解决了一个长期存在的争议,即虽然CBL1/9-CIPK23复合物激活了S型阴离子通道(Slow anion channel-associated 1)SLAC1,但cbl1/9和cipk23突变体表现出耐旱表型。本研究表明,cbl1/9的耐旱表型是负调控ABA受体的造成的。CBL1/9-CIPK可能优先调节ABA受体的活性来负向调节干旱胁迫。以上研究表明,CBL1/9-CIPK1对PYLs活性的负调控是植物优化生长和响应干旱胁迫的一个关键机制。论文的主要结果如下:1.由于cipk1突变体在Ws背景中已经报道对外源ABA敏感,基于不同生态型之间植物表型可能具有差异,首先采用反向遗传学手段发现在Col背景下,CIPK1基因的突变同样会导致拟南芥对ABA敏感。通过表达CIPK1启Dinaciclib小鼠动子驱动的GUS发现CIPK1在气孔中具有高表达,进一步通过土壤干旱以及气孔开度测量等实验证实了CIPK1可能是拟南芥响应ABA信号和干旱胁迫的一个负调控因子。同时对与CIPK1互作的CBL1/9加以研究,发现CBL1/9-CIPK1复合体参与负向调控ABA信号及干旱胁迫响应。2.通过酵母双杂交实验发现CIPK1与ABA受体存在互作可能,随后的双分子荧光互补(Bi FC)实验发现CIPK1与PYLs之间的互作在细胞核、细胞质以及细胞膜上均存在。使用分裂荧光素酶互补(LCI)实验,体外Pull-down实验以及Co-IP实验进一步证实了CIPK1与ABA受体PYR1/PYL1/PYL2/PYL3/PYL4/PYL5/PYL6之间的物理相互作用。此外,利用烟草叶肉细胞原生质体观察到在表达CBL1时,CIPK1与PYLs的互作仅发生在质膜上。3.利用体外磷酸化实验发现CIPK1能够在PYL4保守的Ser129位点磷酸化修饰PYLs以调控PYLs的活性。利用体外重组ABA信号通路以及体外磷酸酶活性等实验发现CIPK1磷酸化修饰的PYLs是无活性的,在存在ABA的条件下不能抑制ABI1的磷酸酶活性。酵母双杂交以及体外Pull-down实验表明磷酸化影响了PYLs与ABI1的互作。同时对磷酸化的PYL4进行了体内分析,结果表明磷酸化不改变PYL4的定位,仅导致PYL4的失活,PYL4和PYL4~(S129A)植物恢复了ABA受体五突变体pyr1pyl2458(12458)对ABA的耐受性和干旱敏感性,同时恢复了生长缺陷表型,而模拟磷酸化的PYL4~(S129D)植物则表现出与12458植物相似的表型。综合体内体外实验结果,说明CIPK1磷酸化的PYLs是无活性的PYLs。4.利用LCI实验发现Sn RK2.6不与CIPK1互作,不参与CIPK1对ABA受体的调节过程。其次通过外源添加ABA发现,使用Co-IP实验以及磷酸化实验证实ABA直接影响CIPK1与PYLs之间的物理互作,进而影响CIPK1对PYLs的磷酸化。最后通过构建12458/cipk1突变体进行遗传学实验表明CIPK1位于PYLs上游磷酸化PYLs发挥功能。基于上述研究内容提出了Ca~(2+)信号负向调节ABA信号的新机制。在正常条件下,Ca~(2+)感受器CBL1/9-CIPK1通过在保守的PYL4~(S129)磷酸化ABA受体PYLs负向调控ABA信号,保证植物的正常生长发育;在干旱胁迫下,ABA直接抑制CIPK1与PYLs之间的互作,有活性的ABA受体传递干旱信号,保障植物渡过干旱逆境。这种Ca~(2+)信号对ABA信号的反馈调节机制在植物平衡生长与适应环境中发挥着重要作用,研究成果为作物抗旱育种奠定了理论基础。

心律失常(Cardiac arrhythmia)为临床常见的心血管病症,具有发病率高、危害性大的特点,可导致心源性猝死(Sudden cardiac death,SCD)的发生。目前仍是全球共同面临的公共卫生问题之一,奎尼丁、胺碘酮等是临床上应用较为广泛的抗心律失常西药,但由于其均有不同程度促心律失常的副作用,该类药物的应用具有一定局限性。然而,天然药物和中药中有多种活性物质可应用于心脑血管领域,从其中寻找具有抗心律失常活性的有效物质,成为发现和开发新药的重要手段之一。目的本课题旨在研究野黄芩素的制备方法,并在活性验证下对其进行结构修饰。通过野黄芩素衍生物对氯化钡和乌头碱诱发大鼠心律失常、心电学指数的影响以及其对电压门控离子通道的调节机制,探究野黄芩素衍生物的抗心律失常活性及作用机制,并与模板分子野黄芩素进行对比。以期发现活性更强、成药性更佳的抗心律失常活性物质,为深入探讨野黄芩素的应用以及抗心律失常药物的开发提供参考。方法1.野黄芩素的制备以野黄芩苷为原料,95%乙醇为溶剂,利用浓硫酸于氮气保护条件下回流4h将其糖苷键AZD2281水解断裂,得到野黄芩素。2.野黄芩素的结构修饰以野黄芩素为原料,对其A环、B环和A、B环进行结构修饰。首先利用二氯二苯甲烷保护野黄芩素A环上邻二酚羟基得到中间体,其次在中间体B环4’位羟基上引入不同的基团如:吗啉-4-甲酰氯、4-甲基哌嗪-1-甲酰氯、乙基氨基甲酰氯等,最后在钯碳氢气下将保护基脱下,得到目标产物。3野黄芩素衍生物的抗心律失常活性测定本部分先以氯化钡复制大鼠心律失常模型探讨野黄芩素衍生物的抗心律失常活性差异。舌下静脉给药后,记录大鼠心电图和心电学指数,探究野黄芩素及其衍生物的恢复时间和维持时间差异,以及对HR、QT、QTc和RR心电学指数的影响,综合分析筛选出抗心律失常活性较佳的化合物Wconductive biomaterials8、W12和W15。进一步研究化合物W8、W12和W15对乌头碱诱发大鼠心律失常模型的影响。舌下静脉给药后观察大鼠心电图,记录大鼠心脏出现室早(VP)、室速(VT)、室颤(VF)和停搏(CA)的时长,分别换算成乌头碱的用量。探究野黄芩素及其衍生物所需乌头碱用量的差别,筛选出抗心律失常活性最佳的化合物W12。最后研究化合物W12不同给药剂量(2、4、8和16mg/kg)对氯化钡和乌头碱诱发大鼠心律失常模型的影响,得出最佳给药剂量为8mg/kg。用化合物W12的最佳给药浓度8mg/kg,进一步研究此剂量对健康大鼠正常心电学指数的影响,充分考虑其成药性。4.抗心律失常活性最佳化合物W12的机制研究本部分将研究抗心律失常活性最佳的化合物W12对HFL1和HEK293T细胞毒性情况,考察其成药性。将化合物W12与Nav1.1和Cav1.1进行分子对接,与野黄芩素对比评分情况。应用膜片钳技术探讨该化合物对HEK293细胞Nav1.1和Cav1.2离子通道的作用机制。结果1.野黄芩素的制备情况以野黄芩苷为原料,用浓硫酸对其糖苷键进行水解,经核磁和质谱验证得到野黄芩素。2.野黄芩素的结构修饰情况以野黄芩素为原料,用二氯二苯甲烷保护其A环邻二酚羟基,经核磁和质谱验证得1个A环结构修饰化合物中间体;以中间体为原料,于其B环4’位引入吗啉-4-甲酰氯和氯丁酰氯后钯碳氢气下脱保护基,核磁和质谱验证得到2个B环结构修饰化合物;以中间体为原料,于其B环4’位引入吗啉-4-甲酰氯、4-甲基哌嗪-1-甲酰氯、乙基氨基甲酰氯等,经核磁和质谱验证得到19个A、B环结构修饰化合物。3.野黄芩素衍生物抗心律失常活性测定情况通过探讨野黄芩素衍生物对氯化钡诱发大鼠心律失常的影响情况,发现与野黄芩素比,野黄芩素衍生物均可显著缩短恢复时间(P<0.001);其中化合物W8、W12和W15的维持时间均较长,其中与野黄芩素比,化合物W12可显著延长维持时间(P<0.05),且维持时间大于20min的selleckchem大鼠只数最多。化合物W8、W12和W15几乎不影响大鼠HR、QT、QTc和RR的心电学指数,且均可纠其指数异常。进一步研究对乌头碱诱发大鼠心律失常的影响,发现与野黄芩素比,化合物W12可显著提高致使大鼠发生室颤(VF,P<0.05)和停搏(CA,P<0.01)的乌头碱用量。探讨化合物W12不同给药剂量(2、4、8和16mg/kg)对氯化钡诱发大鼠心律失常影响情况,发现化合物W12给药标准为8mg/kg时,与野黄芩素比,具有较快的恢复时间(P<0.001)和较长的维持时间,且维持时间大于20min的大鼠只数最多,因此最佳给药标准定为8mg/kg。用最佳给药标准8mg/kg给予健康大鼠,探究化合物W12对大鼠正常心电图的影响,发现与生理盐水组比,化合物W12不会引起大鼠心电学指数异常(P>0.05),与氯化钡组比,化合物W12可显著纠正氯化钡引起的大鼠HR、QT、QTc和RR心电学指数异常(P<0.05)。4.抗心律失常活性最佳化合物W12的机制研究情况化合物W12浓度为25μM时对HFL1和HEK293T细胞均表现出较低的毒性,提示其成药性良好。化合物W12与Nav1.5蛋白和Cav1.1蛋白的结合分数情况均优于野黄芩素。应用膜片钳技术验证了30μM浓度时,化合物W12可使Nav1.5通道开放时间变短,而对Cav1.2通道的IC_(50)值大于30μM。结论本研究所合成的野黄芩素衍生物相比野黄芩素均有起效快的特点,其中化合物W12的恢复时间短、维持时间长且维持时间大于20min的大鼠只数最多。另一方面,化合物W12可显著提高致使大鼠发生室颤(VF)和停搏(CA)的乌头碱用量。给药标准为8mg/kg时,不会引起大鼠心电学指数异常,且可纠正氯化钡引起的大鼠HR、QT、QTc和RR心电学指数异常。化合物W12浓度为25μM时几乎对HFL1和HEK293T细胞无毒性,成药性较好。化合物W12与Nav1.5和Cav1.2离子通道有较强的亲和力,浓度为30μM时会明显加快Nav1.5的失活,而大于30μM时才可检测到Cav1.2通道的IC_(50)值,说明化合物W12对离子通道作用温和,不会过度抑制多个离子通道,有利于离子通道之间恢复平衡。据此,化合物W12可作为具有开发前景的抗心律失常药物深入研究。