PI3K抑制剂 – Page 4 – 关于PI3K抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的实验

异槲皮素通过激活YAP蛋白对巨噬细胞极化表型的影响

目的：探讨异槲皮素（I S O）对巨噬细胞极化表型的影响及相关分子机制。方法：体外培养RAW264.7、THP-1细胞株，采用CCK-8法检测ISO作用后巨噬细胞活力。根据CCK-8结果设置低、中、高hepatic protective effects剂量ISO组，采用Western Blot、RT-qPCR、流式细胞术检测ISO对M0及M2型巨噬细胞中M2型标志物及Yes相关蛋白（YAP）表达水平的影响。此外，加入YAP抑制剂，检测其对巨噬细胞极化表型的影响。结果：在M0及M2巨噬细胞模型中，selleck抑制剂ISO作用巨噬细胞24 h后，细胞中M2型标志物甘露糖受体（CD206）及YAP表达量增加（P<0.05,P<0.01）。流式细胞术也证实ISO作用后巨噬细胞中CD206平均荧光强度（MFI）显著升高（P<0.05,PF-6463922P<0.01）。此外，YAP抑制剂能减弱ISO上调巨噬细胞CD206表达（P<0.01）。结论：异槲皮素作为免疫调节剂，可以通过激活YAP从而促进巨噬细胞抗炎M2表型的极化。

高粱紫色叶突变体sbsn1的表型及理化特性分析

采用EMS诱变野生型高粱BTx623种子的方法获得紫色叶突变体。以野生型BTx623为对照，进行成熟期农艺性状调查和苗期生理生化指标测定。结果表HDAC抑制剂明，sbsn1与BTx623相比，穗长、穗柄长、株高、粒数、千粒重、和穗宽均极显著降低，茎粗和节数极显著增加，突变体sbsn1的粒数降低到BTx623的1/2，抽穗期延后了20～30 d。缺氮条件下苗期叶片叶绿素测定结果显示，突变体sbsn1叶绿素降低幅度cysteine biosynthesis大于BTx623，初步推断出缺氮可能导致依赖光的光合作用能力减弱、使叶片中的叶绿素含量降低；突变体sbsn1叶片花青素含量、可溶性糖及总淀粉含量在缺氮条件下极显著高于BTx623。说明突变体sbsn1具有较强的抵抗缺氮逆境能LEE011力以维持自身正常生长。高粱作为C4植物，光合效率高，耐瘠薄，养分和水分利用效率是C3作物的2倍，但是对高粱养分吸收利用机制研究较少，本研究通过对高粱氮缺乏条件下根伸长不敏感突变体sbsn1，进行农艺性状以及苗期理化特性的测定，为下一步新基因定位以及基因功能的研究提供重要依据。

云南省瑞丽市2019年登革病毒基因型特征研究

【目的】探讨2019年云南省瑞丽市登革病毒血清型及基因型特点,为当地制定有效的登革热防控策略和措施提供依据。【方法】收集2019年瑞丽市Alisertib体内登革热(Dengue fever,DF)患者急性期血清标本,并储存于云南省寄生虫病防治所资源库-80℃冰箱。采用Axy Prep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒提取DF患者急性期血清中登革病毒(Dengue virus,DENV)RNA,采用实时荧光定量PCR法(Quantitative Real Time PCR,q PCR)对DENV核酸检测和血清型鉴定,DENV核酸检测阳性标本血清接种至Vero细胞进行病毒分离培养,提取盲传三代后DENV毒株RNA,经逆转录-聚合酶链式反应法(Reverse transcription PCR,RT-PCR)扩增和琼脂糖凝胶电泳后,切胶回收纯化,将纯化DNA送至生工生物工程股份有限公司(昆明)进行双向测序。在GenMultiplex Immunoassays Bank中检索并下载全球不同年代和不同流行地区的参考序列,使用Snap Gene、Seq Man、Editseq、MEGA X和Megalign等生物学软件进行E基因序列拼接、DENV系统进化树及其核苷酸相似性(氨基酸同源性)分析。采用Excel 2019对瑞丽市2019年DENV数据和相关资料进行分析处理。【结果】共对瑞丽市2019年瑞丽市1000份疑似DF病例急性期血清标本进行DENV核酸检测,其中18份呈阳性,阳性率为1.8%(18/1000);共检测出3种DENV血清型,其中DENV-Ⅰ型2份(11.11%,2/18),DENV-Ⅱ型1份(5.56%,1/18),DENV-Ⅲ型15份(83.33%,15/18),未检测到DENV-Ⅳ型。盲传三代后分离培养出DENV-Ⅰ型毒株2株、DENV-Ⅱ型毒株1株、DENV-Ⅲ型毒株5株;其中扩增出6株毒株E基因目标片,包括DENV-Ⅰ型2株(33.33%,2/6),DENV-Ⅱ型1株(16.67%,1/6),DENV-Ⅲ型3株(50%,3/6)。从系统发育显示,2株DENV-Ⅰ型属于基因型Ⅰ型(Genotype I,G-I),1株DENV-Ⅱ型属于基因型AsianⅠ型,2株DENV-Ⅲ型属于基因型Ⅰ型(Genotype I,G-I)和1株DENV-Ⅲ型属于基因型Ⅲ型(GenotypeⅢ,G-Ⅲ)。对DENV E基因核苷酸相似性分析发现,2株DENV-Ⅰ型E基因核苷酸相似性为98.3%(96.6%),与2019年泰国株(MZ619040)同在一小支,核苷酸相似寻找更多性为97.5%～98.2%,与1945年DENV-Ⅰ原型株(AF425619)核苷酸相似性为92.3%～93.2%;1株DENV-Ⅱ型单独在一个亚分支,与2019年缅甸株(MW788983)、2018年缅甸株(MW788982、MW788981)核苷酸相似性分别为99.7%和99.6%,与1944年DENV-Ⅱ原型毒株(AB609589)核苷酸相似性仅为93.9%;3株DENV-Ⅲ型E基因核苷酸相似性为90.6%～99.6%,其中RL01、RL17株核苷酸相似性高达99.6%;RL01株与2018年缅甸株(MW788903)同在一小分支,核苷酸相似性高达99.8%,RL17株单独在一个亚分支上,与2019年缅甸株(MW788899)、2018年缅甸株(MW788912、MW788903)、2017年缅甸株(MW788879)核苷酸相似性高达99.7%,RL04株与2018年缅甸株(MW788907、MW788911)、2017年缅甸株(MW788887)同在一分支,核苷酸相似性高达99.5%～99.7%,与1956年DENV-Ⅲ原型株H87株(AB609590)核苷酸相似性为92.3%～93.1%。【结论】2019年云南省瑞丽市主要存在3种DENV血清型和4种基因型,即DENV-Ⅰ型G-Ⅰ型、DENV-Ⅱ型AsianⅠ型、DENV-Ⅲ型G-Ⅰ型、DENV-Ⅲ型G-Ⅲ型;其中DENV-Ⅲ基因G-Ⅲ型为瑞丽首次发现;DENV-Ⅰ型毒株可能源于泰国输入,DENV-Ⅱ型毒株和DENV-Ⅲ型毒株可能源于缅甸输入,建议相关部门加强DENV基因型监测。

拟南芥CBL1/9-CIPK1-PYLs功能模块负反馈调控干旱胁迫的分子机理

干旱对农gibberellin biosynthesis业生产和人类活动造成了严重威胁,在过去十年中,由于干旱造成的全球作物生产损失已经增加到约300亿美元。随着全球人口的增加,对水的需求也将增加。我国降雨在地理分布上呈现南多北少,东多西少的常态,北方地区长期面临着土壤干旱的巨大挑战,干旱面积占全国耕地总面积的一半以上。因此,阐明植物抗旱的分子机制和发掘植物的抗旱调控网络是现代农业发展的一个重大挑战,对农业可持续发展至关重要。植物激素脱落酸(Abscisic acid,ABA)作为重要的逆境激素,是植物应对逆境的重要调节激素之一。植物体内的ABA由ABA受体Pyrabactin resistance 1(PYR1)和PYRPUN30119临床试验1-like(PYL)proteins(PYLs)所感知,并由其启动下游信号调控网络。ABA受体的转录后调控是激活ABA信号的重要因素,已经成为众多研究的主题。钙离子(Ca~(2+))是真核生物中常见的第二信使之一,一直是植物细胞信号转导的难点和热点。外界刺激所产生的Ca~(2+)信号由Ca~(2+)感受器所感知,钙调素磷酸酶B亚基蛋白Calcineurin B-like proteins(CBLs)及其互作蛋白激酶CBL-Interacting protein kinases(CIPKs)作为一类重要的Ca~(2+)感受器,广泛参与调控植物生长发育与逆境胁迫等过程。在干旱胁迫下,ABA通过环核苷酸门控通道Cyclic nucleotide gated channels(CNGCs)介导的胞质Ca~(2+)的震荡在植物响应干旱中同样发挥着重要作用。然而,目前还没有研究明确Ca~(2+)信号是否可以反馈调节ABA信号传导。本文通过一系列的生理学和细胞生物学实验发现,Ca~(2+)感受器CBL1/9-CIPK1通过磷酸化修饰ABA受体PYLs负向调控ABA信号与干旱胁迫响应。此外,研究结果解决了一个长期存在的争议,即虽然CBL1/9-CIPK23复合物激活了S型阴离子通道(Slow anion channel-associated 1)SLAC1,但cbl1/9和cipk23突变体表现出耐旱表型。本研究表明,cbl1/9的耐旱表型是负调控ABA受体的造成的。CBL1/9-CIPK可能优先调节ABA受体的活性来负向调节干旱胁迫。以上研究表明,CBL1/9-CIPK1对PYLs活性的负调控是植物优化生长和响应干旱胁迫的一个关键机制。论文的主要结果如下:1.由于cipk1突变体在Ws背景中已经报道对外源ABA敏感,基于不同生态型之间植物表型可能具有差异,首先采用反向遗传学手段发现在Col背景下,CIPK1基因的突变同样会导致拟南芥对ABA敏感。通过表达CIPK1启Dinaciclib小鼠动子驱动的GUS发现CIPK1在气孔中具有高表达,进一步通过土壤干旱以及气孔开度测量等实验证实了CIPK1可能是拟南芥响应ABA信号和干旱胁迫的一个负调控因子。同时对与CIPK1互作的CBL1/9加以研究,发现CBL1/9-CIPK1复合体参与负向调控ABA信号及干旱胁迫响应。2.通过酵母双杂交实验发现CIPK1与ABA受体存在互作可能,随后的双分子荧光互补(Bi FC)实验发现CIPK1与PYLs之间的互作在细胞核、细胞质以及细胞膜上均存在。使用分裂荧光素酶互补(LCI)实验,体外Pull-down实验以及Co-IP实验进一步证实了CIPK1与ABA受体PYR1/PYL1/PYL2/PYL3/PYL4/PYL5/PYL6之间的物理相互作用。此外,利用烟草叶肉细胞原生质体观察到在表达CBL1时,CIPK1与PYLs的互作仅发生在质膜上。3.利用体外磷酸化实验发现CIPK1能够在PYL4保守的Ser129位点磷酸化修饰PYLs以调控PYLs的活性。利用体外重组ABA信号通路以及体外磷酸酶活性等实验发现CIPK1磷酸化修饰的PYLs是无活性的,在存在ABA的条件下不能抑制ABI1的磷酸酶活性。酵母双杂交以及体外Pull-down实验表明磷酸化影响了PYLs与ABI1的互作。同时对磷酸化的PYL4进行了体内分析,结果表明磷酸化不改变PYL4的定位,仅导致PYL4的失活,PYL4和PYL4~(S129A)植物恢复了ABA受体五突变体pyr1pyl2458(12458)对ABA的耐受性和干旱敏感性,同时恢复了生长缺陷表型,而模拟磷酸化的PYL4~(S129D)植物则表现出与12458植物相似的表型。综合体内体外实验结果,说明CIPK1磷酸化的PYLs是无活性的PYLs。4.利用LCI实验发现Sn RK2.6不与CIPK1互作,不参与CIPK1对ABA受体的调节过程。其次通过外源添加ABA发现,使用Co-IP实验以及磷酸化实验证实ABA直接影响CIPK1与PYLs之间的物理互作,进而影响CIPK1对PYLs的磷酸化。最后通过构建12458/cipk1突变体进行遗传学实验表明CIPK1位于PYLs上游磷酸化PYLs发挥功能。基于上述研究内容提出了Ca~(2+)信号负向调节ABA信号的新机制。在正常条件下,Ca~(2+)感受器CBL1/9-CIPK1通过在保守的PYL4~(S129)磷酸化ABA受体PYLs负向调控ABA信号,保证植物的正常生长发育;在干旱胁迫下,ABA直接抑制CIPK1与PYLs之间的互作,有活性的ABA受体传递干旱信号,保障植物渡过干旱逆境。这种Ca~(2+)信号对ABA信号的反馈调节机制在植物平衡生长与适应环境中发挥着重要作用,研究成果为作物抗旱育种奠定了理论基础。

拟南芥CBL1/9-CIPK1-PYLs功能模块负反馈调控干旱胁迫的分子机理

野黄芩素结构修饰与抗心律失常活性研究

心律失常(Cardiac arrhythmia)为临床常见的心血管病症,具有发病率高、危害性大的特点,可导致心源性猝死(Sudden cardiac death,SCD)的发生。目前仍是全球共同面临的公共卫生问题之一,奎尼丁、胺碘酮等是临床上应用较为广泛的抗心律失常西药,但由于其均有不同程度促心律失常的副作用,该类药物的应用具有一定局限性。然而,天然药物和中药中有多种活性物质可应用于心脑血管领域,从其中寻找具有抗心律失常活性的有效物质,成为发现和开发新药的重要手段之一。目的本课题旨在研究野黄芩素的制备方法,并在活性验证下对其进行结构修饰。通过野黄芩素衍生物对氯化钡和乌头碱诱发大鼠心律失常、心电学指数的影响以及其对电压门控离子通道的调节机制,探究野黄芩素衍生物的抗心律失常活性及作用机制,并与模板分子野黄芩素进行对比。以期发现活性更强、成药性更佳的抗心律失常活性物质,为深入探讨野黄芩素的应用以及抗心律失常药物的开发提供参考。方法1.野黄芩素的制备以野黄芩苷为原料,95%乙醇为溶剂,利用浓硫酸于氮气保护条件下回流4h将其糖苷键AZD2281水解断裂,得到野黄芩素。2.野黄芩素的结构修饰以野黄芩素为原料,对其A环、B环和A、B环进行结构修饰。首先利用二氯二苯甲烷保护野黄芩素A环上邻二酚羟基得到中间体,其次在中间体B环4’位羟基上引入不同的基团如:吗啉-4-甲酰氯、4-甲基哌嗪-1-甲酰氯、乙基氨基甲酰氯等,最后在钯碳氢气下将保护基脱下,得到目标产物。3野黄芩素衍生物的抗心律失常活性测定本部分先以氯化钡复制大鼠心律失常模型探讨野黄芩素衍生物的抗心律失常活性差异。舌下静脉给药后,记录大鼠心电图和心电学指数,探究野黄芩素及其衍生物的恢复时间和维持时间差异,以及对HR、QT、QTc和RR心电学指数的影响,综合分析筛选出抗心律失常活性较佳的化合物Wconductive biomaterials8、W12和W15。进一步研究化合物W8、W12和W15对乌头碱诱发大鼠心律失常模型的影响。舌下静脉给药后观察大鼠心电图,记录大鼠心脏出现室早(VP)、室速(VT)、室颤(VF)和停搏(CA)的时长,分别换算成乌头碱的用量。探究野黄芩素及其衍生物所需乌头碱用量的差别,筛选出抗心律失常活性最佳的化合物W12。最后研究化合物W12不同给药剂量(2、4、8和16mg/kg)对氯化钡和乌头碱诱发大鼠心律失常模型的影响,得出最佳给药剂量为8mg/kg。用化合物W12的最佳给药浓度8mg/kg,进一步研究此剂量对健康大鼠正常心电学指数的影响,充分考虑其成药性。4.抗心律失常活性最佳化合物W12的机制研究本部分将研究抗心律失常活性最佳的化合物W12对HFL1和HEK293T细胞毒性情况,考察其成药性。将化合物W12与Nav1.1和Cav1.1进行分子对接,与野黄芩素对比评分情况。应用膜片钳技术探讨该化合物对HEK293细胞Nav1.1和Cav1.2离子通道的作用机制。结果1.野黄芩素的制备情况以野黄芩苷为原料,用浓硫酸对其糖苷键进行水解,经核磁和质谱验证得到野黄芩素。2.野黄芩素的结构修饰情况以野黄芩素为原料,用二氯二苯甲烷保护其A环邻二酚羟基,经核磁和质谱验证得1个A环结构修饰化合物中间体;以中间体为原料,于其B环4’位引入吗啉-4-甲酰氯和氯丁酰氯后钯碳氢气下脱保护基,核磁和质谱验证得到2个B环结构修饰化合物;以中间体为原料,于其B环4’位引入吗啉-4-甲酰氯、4-甲基哌嗪-1-甲酰氯、乙基氨基甲酰氯等,经核磁和质谱验证得到19个A、B环结构修饰化合物。3.野黄芩素衍生物抗心律失常活性测定情况通过探讨野黄芩素衍生物对氯化钡诱发大鼠心律失常的影响情况,发现与野黄芩素比,野黄芩素衍生物均可显著缩短恢复时间(P<0.001);其中化合物W8、W12和W15的维持时间均较长,其中与野黄芩素比,化合物W12可显著延长维持时间(P<0.05),且维持时间大于20min的selleckchem大鼠只数最多。化合物W8、W12和W15几乎不影响大鼠HR、QT、QTc和RR的心电学指数,且均可纠其指数异常。进一步研究对乌头碱诱发大鼠心律失常的影响,发现与野黄芩素比,化合物W12可显著提高致使大鼠发生室颤(VF,P<0.05)和停搏(CA,P<0.01)的乌头碱用量。探讨化合物W12不同给药剂量(2、4、8和16mg/kg)对氯化钡诱发大鼠心律失常影响情况,发现化合物W12给药标准为8mg/kg时,与野黄芩素比,具有较快的恢复时间(P<0.001)和较长的维持时间,且维持时间大于20min的大鼠只数最多,因此最佳给药标准定为8mg/kg。用最佳给药标准8mg/kg给予健康大鼠,探究化合物W12对大鼠正常心电图的影响,发现与生理盐水组比,化合物W12不会引起大鼠心电学指数异常(P>0.05),与氯化钡组比,化合物W12可显著纠正氯化钡引起的大鼠HR、QT、QTc和RR心电学指数异常(P<0.05)。4.抗心律失常活性最佳化合物W12的机制研究情况化合物W12浓度为25μM时对HFL1和HEK293T细胞均表现出较低的毒性,提示其成药性良好。化合物W12与Nav1.5蛋白和Cav1.1蛋白的结合分数情况均优于野黄芩素。应用膜片钳技术验证了30μM浓度时,化合物W12可使Nav1.5通道开放时间变短,而对Cav1.2通道的IC_(50)值大于30μM。结论本研究所合成的野黄芩素衍生物相比野黄芩素均有起效快的特点,其中化合物W12的恢复时间短、维持时间长且维持时间大于20min的大鼠只数最多。另一方面,化合物W12可显著提高致使大鼠发生室颤(VF)和停搏(CA)的乌头碱用量。给药标准为8mg/kg时,不会引起大鼠心电学指数异常,且可纠正氯化钡引起的大鼠HR、QT、QTc和RR心电学指数异常。化合物W12浓度为25μM时几乎对HFL1和HEK293T细胞无毒性,成药性较好。化合物W12与Nav1.5和Cav1.2离子通道有较强的亲和力,浓度为30μM时会明显加快Nav1.5的失活,而大于30μM时才可检测到Cav1.2通道的IC_(50)值,说明化合物W12对离子通道作用温和,不会过度抑制多个离子通道,有利于离子通道之间恢复平衡。据此,化合物W12可作为具有开发前景的抗心律失常药物深入研究。

坛紫菜丝状体不同诱变方法的比较研究

为建立一种新型高效诱变坛紫菜自由丝状体的方法，对~(60)Co-γ射线、甲基磺酸乙酯（EMS）、紫外线（UV）处理的单因子诱变方法与~(60)Co-γ射线-UV(36 W,35 cm）、~(60)Co-γ射线-EMS处理的双因子诱变方法进行比较，观测丝状确认细节体的细胞形态、致死率、突变率、F_v/F_m的变化。结果表明，以突变率和半致死剂量为筛选标准，单因子最佳诱变条件分别为辐射剂量为1 000 Gy的~(60)Co-γ射线、0.1 mol·L~(-1)的EMS处理2 h、36 W UV照射180 min，最高突变率分别为0.024%、0.025%、0.0Medicines information32%。双因子最佳诱变条件为1 000 Gy的~(60)Co-γ射线和UV照射180 min、1 0GSK1349572临床试验00 Gy的~(60)Co-γ射线和0.1 mol·L~(-1)的EMS处理2 h，最高突变率分别为0.082%和0.060%。此外，在观察和培养突变体21 d后，~(60)Co-γ射线、EMS、UV、~(60)Co-γ射线-UV和~(60)Co-γ射线-EMS的最高突变率分别下降至0.013%、0.011%、0.014%、0.040%和0.023%，表明辐射剂量为1 000 Gy的~(60)Co-γ射线和UV照射180 min的双因子诱变方式能得到较高的突变率，是新型高效的双因子诱变方法。本研究结果为坛紫菜自由丝状体突变体的分离纯化和基础研究提供了材料，同时为坛紫菜诱变育种研究提供了参考。

籼型血缘对粳稻产量和品质的影响

籼粳杂交是我国北方粳型超级稻育种的SCH727965 molecular weight总体技术路线,但是籼型血缘在我国粳稻育种中的作用还有待探讨。本试验分别以籼粳交重组自交系(RILs)和粳稻主要稻区不同年代主栽品种为试材,分析籼型血缘对东北水稻产量和品质的影响,并应用CRISPR/Cas9基因编辑技术对高频籼型位点进行定点基因编辑,以期阐明高频籼型位点参与的生物学进程和所调控的重要农艺性状,取得以下主要结果:1.以粳型超级稻品种沈农265(SN265)和籼型恢复系材料泸恢99(R99)杂交构建的包括151个株系的RILs群体为材料,分别在广东、四川、江苏和辽宁种植,调查20个产量和品质相关性状。结果显示产量构成因素中只有千粒重在四地区没有显著性差异,其他性状均受环境条件影响。抽穗期随着纬度增加而增加,而粗蛋白含量展现出随着纬度增加而降低的趋势。2.RILs中籼型频率呈正态分布,与粒长、粒形呈显著正相关,与粒宽、整精米率呈显著负相关。随着纬度的增加,籼型频率与粒形和垩白度的相关性增强,而与抽穗期和着粒密度的相关性减弱。因为籼型频率与粒形呈显著负相关,故籼型频率可能主要影响粒形。3.试验前期收集了各粳稻稻区不同年代的74份粳稻主栽品种,在Illumina平台进行了高通量测序,平均测序深度达到53×。应用数据库中517份水稻农家品种重测序信息定义的籼粳分化SNP位点,分析各品种每条染色体上籼型血缘的分布,发现籼型血缘在染色体上分布并不均匀,其中5、11和12染色体籼型血缘显著高于其他染色体。对比发现江苏省和辽宁省的主栽品种籼型血缘显著高于黑龙江省和山东patient medication knowledge省,而且2000年后育成的品种籼型血缘显著高于2000年之前,籼型血缘渗入主要增加了我国粳稻品种的每穗粒数。4.试验分析了我国粳稻品种中籼型血缘渗入区域内与产量和品质相关的关键基因。发现辽宁省的主栽品种盐丰47,其产量潜力高,千粒重达到26.2 g,高于大部分粳稻品种,但是垩白性状有待提高。试验发现在盐丰47的5号染色体上有一段籼型血缘渗入片段,包含了粒形调控基因GS5和垩白调控基因Chalk5。测序结果表明盐丰47中GS5和Chalk5的基因序列均与籼稻品种珍汕97相同,暗示在盐丰47的育种过程中为了提高产量潜力而引入了增加千粒重的籼型GS5等位基因,但是与GS5紧密连锁的Chalk5也随之渗入,引起其垩白性状下降。试验应用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除了盐丰47的Chalk5基因,纯合基因编辑植株粒型与盐丰47相似,其垩白此网站性状得到了显著的改善。5.测序发现一些位点在大部分粳稻种质资源中都为籼型,数据库比对发现这些位点中有多个育性和抗性调控基因。此外筛选到了26个功能未知的高频籼型位点,并已经完成了这26个位点的CRISPR基因编辑载体构建和遗传转化,目前正在海南加代。本研究分别以籼粳交重组自交系(RILs)和粳稻主要稻区不同年代主栽品种为试材,分析籼型血缘对东北水稻产量和品质的影响,揭示了籼型血缘影响的相关基因对重要农艺性状的影响,可以最大限度避开亚种间杂交产生的负面影响,直接扩宽粳型栽培稻的遗传多样性,为进一步提升育种潜力提供遗传基础。

医用镁合金表面静电纺丝纳米复合涂层的制备与性能研究

镁合金因其具有优异的综合力学性能、良好的生物相容性以及可降解性,近年来,在骨植入材料领域受到了广泛的关注。然而,镁合金的性质过于活泼,作为植入材料时在人体内的降解速度太快,使其无法在完整的服役周期内持续地提供力学支撑作用。除此之外,镁合金的高降解速率也会对人体产生一系列负面影响,比如皮下气肿和局部碱化等。这大大限制了镁合金在临床上的应用。针对这一问题,对镁合金进行表面改性处理是解决其降解速率过快的最有效的手段之一。本文首先利用水热法在AZ31镁合金表面制备了层状双氢氧化物(LDH)涂层,对不同水热反应时间下制备的LDH涂层的耐腐蚀性进行分析和比较。然后,选出其中耐腐蚀性最好的镁合金涂层样品,在其基础上使用静电纺丝技术制备一层多孔的静电纺丝聚己内酯(PCL)涂层,与LDH涂层一起形成纳米复合涂层。同时,用不同浓度负载锌离子的聚多巴胺(PDA)对该复合涂层进行修饰,进一步提高涂层的生物相容性以及赋予其抗菌能力。通过X射线衍射仪、场发射电子扫描显微PLX-4720体内实验剂量镜、傅里叶红外光谱https://www.selleck.cn/products/cb-839.html、X射线光电子能谱、电感耦合等离子体发射光谱仪等分析测试手段对涂层的组成成分及结构进行了表征。并通过接触角测试、电化学测试、体外模拟浸泡测试、细胞毒性实验以及抗菌实验等手段对涂层的性能进行了研究。实验结果表明,通过水热反应制备出的LDH涂层的主要成分为Mg-Al LDH和Mg(OH)_2,并且当水热反应时间为12 h时,涂层样品具有最好的耐腐蚀性。进一步在LDH涂层上制备PCL静电纺丝涂层,当选用的溶剂体系为二氯甲烷(DCM):二甲基甲酰胺(DMF)=7:3、PCCalakmul biosphere reserveL纺丝液浓度为13%、纺丝电压为12 k V、推注速度为1 m L/h时,所制备出的涂层纤维光滑、连续且无珠粒。纤维直径主要分布在100 nm-500 nm之间,纤维整体较为均匀。电化学测试和浸泡实验结果表明,该涂层进一步提高了镁合金的耐腐蚀性。使用不同浓度的负载锌离子的聚多巴胺对PCL静电纺丝复合涂层进行修饰,结果表明,聚多巴胺螯合锌离子成功附着在PCL静电纺丝复合涂层上。随着聚多巴胺浓度提高,复合涂层上负载的锌离子就越多,并且涂层的亲水性也越好。涂层的耐腐蚀性虽比未修饰的PCL静电纺丝涂层略微下降,但仍旧高于单一的LDH涂层。抗菌实验结果表明,使用负载锌离子的聚多巴胺对PCL复合涂层进行修饰,有效提高了复合涂层的抗菌能力。细胞毒性实验结果表明,复合涂层有效提高了镁合金样品的生物相容性。使用负载锌离子的聚多巴胺对涂层进行修饰后,在低浓度下,涂层的细胞相容性得到了进一步改善,但是当聚多巴胺浓度过高时,其负载的大量锌离子会对细胞的增殖产生一定的抑制作用。

DCIP通过维持线粒体稳态调控巨噬细胞在急性炎症中的免疫应答

背景:在细菌感染急性期的病理过程中,炎症的转归是消退还是扩大,不仅是机体和入侵病原体动态博弈的过程,也是一系列复杂免疫调控的结果,但是上述机制尚未得到充分阐明。本课题旨在寻找新的急性炎症相关分子,完善炎症调控机制理论,探索潜在治疗靶点。树突状细胞来源干扰素γ诱导蛋白(dendritic cell-derived interferon-gamma induced protein,DCIP)是本实验室团队于2000年在首次在人类树突状细胞中克隆并鉴定的天然免疫相关蛋白,已有研究证实,DCIP具有如下功能:1.抵御肿瘤和某些自身免疫性疾病;2.参与了抗多种病毒的免疫应答;3.维持细胞基因组的稳定。上述功能的发挥,均同其脱氧核苷三磷酸酶(d NTPase)活性相关,即将d NTP(Deoxyribonucleoside triphosphates)水解为d Ns(脱氧核苷)和PPPi(三磷酸基团)的能力。另外,人源DCIP有一个被认为和抗病毒活性有关的磷酸化位点T592,细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin dependent kinase,CDK)调控该位点的磷酸化,但其是否影响DCIP的d NTP酶活性尚存在争议。在鼠源DCIP与T592对应的同源磷酸化位点为T634,但是对于T634磷酸化是否同样影响DCIP的抗病毒功能目前尚不明确。尽管目前针对DCIP在抗病毒、抗自身免疫和抗肿瘤等方面的研究相对较为深入,但是其是否具有抗细菌感染性炎症的免疫功能及其详细机制,目前尚未有相关报道。本课题的预实验结果表明,在LPS刺激的野生型小鼠巨噬细胞中,DCIP的表达呈时间相关性先升高后降低,提示其可能参与了炎症的天然免疫调控,因此我们决定对其开展进一步研究。方法:我们利用Cas9基因编辑技术,分别构建了髓系Dcip条件性敲除(Dcip~(-/-))小鼠品系和Dcip~(-/-)RAW264.7小鼠巨噬细胞系作为本课题的研究模型,以评估DCIP在LPS诱导急性炎症中的作用。另外,我们构建了全长野生型鼠源DCIP的真核表达载体,并在此基础上构建了如下突变体:1.使DCIP的d NTP酶失活的突变体H238A/D239A;2.使T634位点磷酸化缺失的突变体T634A;3.使T634位点模拟磷酸化的突变体T634D。通过将上述全长DCIP或DCIP突变体在Dcip~(-/-)RAW264.7细胞内过表达并观察表型回复,进一步明确DCIP在急性炎症中的功能,以及在这一过程中,d NTP酶活性和T634磷酸化位点的影响。结果:体内实验结果,腹腔注射LPS的Dcip~(-/-)小鼠相比于对照小鼠血清中IL-6、TNFα、乳酸等炎症因子水平更高;HE染色显示,Dcip~(-/-)小鼠肺组织内有更多炎性细胞浸润,伴有肺泡腔狭窄,肺泡壁增厚等病理特征。在致死量LPS注射下,Dcip~(-/-)小鼠相比于对照小鼠,在60小时观察时间内的存活率显著降低。体外实验结果,LPS刺激的Dcip~(-/-)腹腔巨噬细胞相比于对照细胞表达更高水平的IL-6、TNFα、IFNβ,对LPS-TLR4通路上的关键蛋白总量和磷酸化水平进行检测,发现Dcip~(-/-)腹腔巨噬细胞的TLR4通路活化更显著;在经过M1极化诱导后,Dcip~(-/-)腹腔巨噬细胞相比对照细胞有更高的M1极化比例;另外,在静息和M1极化诱导状态下,Dcip~(-/-)巨噬细胞的线粒体膜电位降低,线粒体来源ROS升高,线粒体有氧呼吸受抑制,而糖酵解代偿性增加。尽管Dcip~(-/-)巨噬细胞的线粒体功能受损,但是并未观察到显著的细胞凋亡,在静息状态的Dcip~(-/-)巨噬细胞中,观察到了线粒体自噬,而对照细胞则无此表型。在Dcip~(-/-)RAW264.7中分别转染全长野生型DCIP及其突变载体,用LPS刺激后检测细胞的IL-6分泌,或诱导细胞向M1极化后,分别检测细胞的膜电位水平、M1细胞极化比例。结果表明,DCIP能够抑制炎症因子分泌、维持线粒体膜电位和抑制细胞的M1极化,上述功能依赖于DCIP的d NTP酶活性,并且受到磷酸化位点T634的调控。最后,我们探索了DCIP调控线粒体功能的潜在互作分子。co-IP和使用激光共聚焦显微镜的免疫荧光共定位分析证实DCIP与电压依赖性阴离子通道1(Voltage Dependent Anion Channel 1,VDAC1)存在相互作用。VDAC1是一个定位于线粒体外膜的通道蛋白,能够转运多种物质通过线粒体外膜,因此可能参与到DCIP介导的线粒体内dNTP池调控,从而影响线粒体基因组的稳定。VDAC1寡聚化将使线粒体外膜上形成孔洞,使细胞色素c泄露至胞浆引发细胞凋亡。另外有研究表明,Pink1-Parkin通路介导的VDAC1泛素化可招募蛋白p62和LC3B,形成线粒体自噬。因此,DCIP-VDAC1相互作用可能通过上述机制影响线粒体的状态。IP联用蛋白鉴定质谱的结果提示,内质网脂筏相关蛋白1(ER Lipid Raft Associated 1,ERLIN1)也和DCIP存在相互作用。在细胞内存一种叫做“线粒体相关内质geriatric oncology网膜”(Mitochondrial Associated ER Membrane,MAM)的微观结构,是内质网和线粒体进行物质运输和信号转导的部位,而内质网脂筏是MAM的组成之一。ERLIN1作为内质网脂筏上的关键蛋白,帮助稳定了MAM,同时ERLIN1被证实通过和AMBRA1、VDAC1的相互作用,调控线粒体自噬。我们的研究结果表明,DCIP和ERLIN1、VDAC1同时存在互作,提示其可能通过MAM结构调控线粒体的功能。结论:本课题发现了LPS-TLR4信号传导新的调节PR-171 IC50机制,DCIP通过与VDAC1、ERLIN1等分子的相互作用,维持线粒体功能、抑制LPS-TLR4通路诱导的急性炎症和巨噬细胞BIBW2992溶解度M1极化。