PI3K抑制剂

MLN8237体内目的 基于生物信息学分析的方法寻找影响弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)的关键miRNA和治疗靶点。方法 对GEO数据库中的基因芯片数据进行检索筛选，获取DLBCL相关的非NN2211临床试验编码RNA(miRNA)表达芯片GSE173080,利用在线分析工具GE02R对芯片数据进行分析，筛选差异表达的miRNA。通过miRWALK软件预测靶基因，并进行miRNA和靶基因的负相关分析。利用DAVID软件对靶基因进行基因本体论Multiplex Immunoassays(gene ontology, GO)和KEGG通路富集分析。通过STRING软件建立蛋白相互作用网络，并进行聚类分析。此外，通过GEPIA数据库进行靶基因的表达验证。结果 共筛选出34个差异表达的miRNA,包括28个表达上调的miRNA和6个下调的miRNA。结论 hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-212-3p和hsa-miR-28-5p是影响DLBCL的关键的肿瘤抑制miRNA,其对应的靶基因为将来DLBCL的临床诊断和靶向治疗提供了相关依据。

Telaglenastat试剂目的：观察温心炙草汤对乳腺癌阿霉素化疗所致心脏毒性的影响。方法：将68例接受4周期阿霉素辅助化疗的早期浸润性乳腺癌心阳虚证患PF-02341066者依据随机数字表随机分为温心组(34例)和对照组(34)例，温心组脱落1例，对照组脱落2例，最终完成方案温心组33例，对照组32例。温心组从第2周期开始每周期化疗后口服温心炙草汤2周，对照组给予对应模拟剂，其他治疗两组相同。观察化疗前后两组患者KPS、MDASI-TCM评分和心脏毒副反应程度、心肌及心衰标志物(肌钙蛋白、肌酸激酶同工酶水平、前端脑钠肽及心电图改变率的变化情况。结果：两组化疗前KPS、MDASITCM、cTnI、CK-MB比较差异均无统计学意义(P>0.05)；对照组化疗后KPS评分低于化疗前(P<0.05),MDASI-TCM评分、cTnI、CK-MB高于化疗前(P<0.05)；温心组化疗后MDASI-TCAutoimmune Addison’s diseaseM评分、CK-MB高于化疗前(P<0.05)；且化疗后，温心组KPS评分高于对照组(P<0.05),MDASITCM评分、cTnI、CK-MB低于对照组(P<0.05)。温心组心脏毒性发生率、NT-BNP和心电图改变率低于对照组(P<0.05)。结论：温心炙草汤可降低乳腺癌阿霉素化疗所致心脏毒性，改善心脏功能。

目的1.分析高原地区非瓣膜性心房颤动(房颤)患者形成血栓事件(本研究中包括左心耳血栓及心源性脑卒中)的预测因子除了已经纳入的血栓栓塞评分(CHA_2DS_2-VASc评分)中的条目,是否有与高原地区慢性疾病相关的危险因素或者与检验指标相关的危险因素,并将筛选出的独立危险因素联合CHA_2DS_2-VASc评分做预测血栓事件的价值评估,以期早期识别血栓高风险的房颤患者,从而对高原地区非瓣膜病房颤患者血栓风险评估探索更适宜的评估工具和更科学的预防血栓栓塞的策略。2.分析高原地区住院心房颤动患者的抗凝治疗现状,为提高本地区医务人员及患者对房颤危害的认识和规范房颤的抗凝治疗提供依据。方法1.录入所有从2018年1月至2022年6月在西藏自治区人民医院内科住院治疗并完善包括左心耳血栓评估、卒中评估等相关检查的非瓣膜病房颤患者(主要为心血管内科及神经内科)157例,其中血栓组51例,非血栓组106例,比较两组间的基线资料,包括临床病史、心脏彩超指标、检验指标是否有显著差异,对于有差异有统计学意义的指标纳入单因素二元Logistic回归分析后进行多因素二元Logistic回归分析,多因素分析前先将单因素分析中差异有统计学意义的变量进行共线性诊断,将所筛选出的血栓事件的独立危险因素联合CHA_2DS_2-VASc评分制定新的评分,最后通过ROC曲线评估不同评分预测血栓事件的性能。2.回顾性收集从2018年1月至2021年12月期间于西藏自治区人民医院住院治疗并出院诊断为房颤或心房颤动、心房纤颤的所有患者共计854例患者的临床资料,对房颤患者临床特征及治疗现状进行详细分析。结果1.本研究共纳入资料完整的研究对象157例,非血栓组106例,血栓组51例;组间比较时,收缩压、舒张压、白细胞、高密度脂蛋白胆固醇、肌红蛋白、肌钙蛋白,甘油三酯差异显著,有统计学意义,而年龄、性别、房颤类型、房颤病因相关疾病及高原相关疾病、CHA_2DS_2-VASc评分、出血评分、心脏彩超结构及功能指标、红细胞、血红蛋白、红细胞压积、血小板、肌酐、尿酸、胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、非高密度脂蛋白胆固醇、肌酸激酶同工酶、超敏C反应蛋白、D-二聚体、纤维蛋白原降解产物、纤维蛋白原等无显著差异;单因素二元Logistic回归分析显示收缩压、舒张压、白细胞、高密度脂蛋白胆固醇、肌红蛋白、肌钙蛋白是房颤相关性血栓的危险因素;多因素二元Logistic回归分析显示白细胞、肌钙蛋白是房颤相关性血栓的独立危险因素;将CHA_2DS_2-VASc评分、白细胞、肌钙蛋白构建ROC曲线显示均对房颤相关性血栓有预测能力;进一步将白细胞、肌钙蛋白、CHA_2DS_2-VASc评分三者联合构建ROC曲线,较单纯CHA_2DS_2-VASc评分预测房颤相关性血栓的AUC值提高0.26。2.本研究共纳入854例房颤住院患者;合并临床相关因素中慢性高山病占7.4%;男性房颤患者的冠心病、慢性高山病显著多于女性,而女性房颤患者的风湿Targeted oncology性心脏病、先天性心脏病显著多于男性,差异均有统计学意义。随着房颤时程的延长,抗凝治疗比例呈上升趋势。非瓣膜性房颤患者781例,随着栓塞评分增高,抗凝治疗比例呈上升趋势,血栓栓塞高危人群抗凝比例达到59.9%,但仍有24.8%的高危患者仅采用抗血小板药,且有23.5%的高危患者未采用任何抗栓治疗;两组年龄、年龄分层、性别、房颤类型、左房内径组间比较差异均有统计学意义;不同房颤类型中以持续性房颤占比最大。结论1.CHA2DS2-VASc+白细胞+肌钙蛋白评分对高原地区房颤相关性血栓风险具有较高的预测价值,其预测能力优于CHA2DS2-VASc评分。2.高原地区40岁以下年龄段房颤患者的基础病因以风湿性心脏病和Wnt-C59生产商冠心病占比最大,40岁及selleck化学以上年龄段房颤患者的基础病因以高血压性心脏病、高原性心脏病、肺源性心脏病为主;2018-2021年抗凝治疗比例较2012-2014年明显升高;需提升节律控制药在房颤患者中的应用率。

光学技术在现代医学中已经得到了广泛的应用,在多种疾病的诊断以及治疗方面均发挥了重要作用。光诊疗分为光诊断与光治疗两个部分,是使用特定波段的光对肿瘤部位进行成像或消除肿瘤的一种微创且高效的诊疗手段。荧光成像(FI)是将荧光物质注射入活体内随后对其进行光激发,荧光物质在被激发后所发射的荧光信号会被机器捕获从而实现对肿瘤部位进行高精度成像的技术。由于在常规波长范围内(400-950 nm)的荧光成像其组织穿透能力有限,近年来科研人员开发了一种用于近红外二区(NIR-Ⅱ,1000-1700 nm)荧光成像的方法。NIRⅡ荧光成像具有光散射低、生物组织自吸收低以及高信噪比等优点,可对生物组织进行高穿透深度和高分辨Sunflower mycorrhizal symbiosis率成像,进一步推动了荧光成像在生物医学中的应用。现如今代表性的荧光染料有:纳米金、单壁碳纳米管(SWCNTs)、量子点(Quantum dot,QD)、稀土掺杂纳米颗粒(Rare earth doped nanoparticles,RENPs)、半导体聚合物纳米颗粒(Semiconductor polymer nanoparticles,SPNs)、小分子染料(Small molecule dye,SMD)等。其中SPNs具有良好的生物相容性和高的光稳定性,已被成功应用于活体荧光成像、光声成像、化学发光成像等。selleck化学光疗具有高效、微创、穿透深度高、副作用小等优点。其中,光热疗法(Photothermal therapy,PTT)是材料在光激发下通过非辐射衰减诱导光热转换对肿瘤进行杀伤的治疗手段。PTT具有可操作性强、特异性高、治疗效果显著等优势。此外,光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)也是一种治疗癌症或其他疾病的有效方法,其原理是通过光敏剂诱导光能转移到周围的氧以产生活性氧(ROS)对病变部位进行杀伤。单一的光疗效果有限,往往会导致肿瘤消除不彻底、易复发和转移等问题。为此,将光疗与化疗、免疫治疗、基因治疗等手段相结合开发联合治疗模式是一种可行的提升光学治疗疗效的方法,也是目前该领域的研究重点。本文基于光学诊疗构建了两种不同的纳米诊疗体系,研究了不同的成像与治疗手段相结合的诊疗平台,具体研究内容如下:(1)负载盐酸阿霉素(DOX)的共轭聚合物纳米粒子用于NIR-Ⅱ荧光成像介导的化疗/光热联合治疗。本章设计了一种可用于NIR-Ⅱ荧光成像和光热治疗、化疗联合治疗的多功能光诊疗体系(SPN@DOX)。首先通过纳米沉淀法用两亲性外包聚合物HA-DSPEPEG包载NIR-Ⅱ半导体聚合物SP制备出纳米粒子SPN,随后利用静电吸附负载药物DOX成功制备出SPN@DOX。由于表面HA的存在,SPN@DOX可与癌细胞特异性结合,将药物靶向输送到肿瘤部位。在808 nm激光照射下,SPN@DOX可以对肿瘤部位进行高效的NIR-Ⅱ荧光成像。同时,在1064 nm激光照射下,SPN@DOX可产生光热效应并结合药物DOX对肿瘤细胞造成联合杀伤。因此,我们开发了一种基于NIR-Ⅱ荧光成像介导的化疗/光热联合治疗的光诊疗纳米平台。(2)掺杂萘酰亚胺的共轭聚合物纳米粒子用于NIR-Ⅱ荧光成像介导的光动力/光热联合治疗。本章中我们设计并合成了一种掺杂萘酰亚胺的水溶性共轭聚合物(NDI-SeDPP-PEG)。首先通过NDI与DPP和三种不同链接单体分别进行1:1:2的聚合,并进行后续的PEG修饰制备了三种材料(NDI-O-DPP-PEG、NDEntinostatI-S-DPP-PEG、NDI-Se-DPP-PEG),随后通过比较三种材料的光动力性能,筛选出性能最为优异的NDI-Se-DPP-PEG材料进行生物实验。研究发现,由于萘酰亚胺的掺入,材料的光动力性能与光热性能都有一定程度的提高,且在掺杂后材料会表现出之前所没有的产生超氧阴离子的能力。通过实验我们发现NDI-Se-DPP-PEG在808 nm激光激发下可以高效地产生活性氧,并且具有高的光热效率。体外研究表明,NDI-Se-DPP-PEG可以有效地被癌细胞摄取,在近红外激光照射下能够高效地杀灭癌细胞(杀伤率:77%)。因此,我们开发了一种通过单一光源激发诱导光热与光动力联合治疗的单组份纳米光诊疗系统。

近年来,我国餐厨垃圾产量日益增长,在能源化需求的推动下,厌氧消化技术成为餐厨垃圾减量化、无害化、资源化最主流的技术,但传统厌氧发酵技术在高有机负荷(OLR)下易出现功能微生物流失问题。脂质是餐厨垃圾的重要组成成分,与碳水化合物和蛋白相比具有更高的产甲烷潜能,但高浓度的脂质会吸附并覆盖在微生物表面,在传统厌氧反应器中会引起更严重的污泥流失问题。而厌氧膜生物反应器(An MBR)能够有效分离HRT和SRT,从而实现功能微生物的高效截留,用于处理高脂质餐厨垃圾具有一定技术优势,但过程中出现的LCFAs积累以及膜污染问题仍旧是阻碍其进一步推广的瓶颈。目前,An MBR用于处理高含油餐厨垃圾的研究仍旧有限,因此,本研究采用外置式An MBR,研究了不同含油率下An MBR处理高脂质餐厨垃圾的产甲烷性能、稳定性能,探明了含油率对An MBR膜污染特性以及微生物群落演替、代谢的影响,为An MBR处理高脂质餐厨垃圾的实际应用及含油率的调控范围提供理论支撑。主要得到如下结论:(1)随着含油率由0%升高至5%,AnMBR系统中的甲烷产率从0.290升高至0.375L-CH_4/g COD,脂质降解率达到最高至78.19%,而COD去除率一直维持在99.24%左右;当含油率进一步升高至8%后,甲烷产率、脂质降解率小幅降低,COD去除率也降至97.40%,系统对回收甲烷的能力降低。而系统稳定性随含油率升高明显降低,VFAs、LCFAs浓度不断升高,至含油率为8%时,VFAs、LCFAs积累浓度分别达到1967.00、999.68mg COD/L,氨氮降低至1100mg N/L,碱度降低至6200mg Ca CO_3/L,碳酸氢盐碱度/总碱度比值逐渐降低至0.6,TVbiomass processing technologiesFA/碱度比值迅速升高至0.31,系统稳定性下降,抵抗酸化的能力较弱。四阶段分析可知,甲烷化阶段对含油率的升高更敏感,在含油率为8%时四阶段不平衡加剧,出现了更高浓度的有机酸积累。(2)挥发性脂肪酸(VFAs)甲烷化特性实验结果显示,随着含油率从0%升高至8%,以乙酸、丙酸为底物的微生物比产甲烷活性(SMA)分别降低22.58%和26.49%,而以丁酸为底物的SMA升高47.58%,表明乙酸、丙酸降解能力变弱,所以此时积累的VFAs主要为乙酸和丙酸。长链脂肪酸(LCFAs)甲烷化特性结果显示,棕榈酸、硬脂酸和油酸的SMA在含油率为8%周期下较含油率为5%周期下出现降低,因此出现了更高浓度的LCFAs积累。嗜氢活性结果表明,随着含油率的升高,氢营养型产甲烷路径的微生物活性明显升高,在含油率为8%周期下达到0.21g CH_4-COD/g VS/d。此外,计算得到微生物产率系数随含油率的升高从13.61%降低至8.86%,流向微生物生长的COD减少,有利于甲烷的生成。(3)微生物群落分析结果表明,能够降解复杂有机GNE-140 NMR大分子的紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)和长杆菌科(Prolixibacteraceae)在不同含油率下的互补分布使得8%周期下仍能保持较好的水解率、酸化率。而在含油率从5%升高至8%时,能够氧化乙酸盐的互养菌科(Synergistaceae)相对丰度从12.74%降至4.09%,这可能是系统中乙酸浓度增加的原因之一;与此同时,乙酸营养型产甲烷菌甲烷丝菌(Methanothrix)丰度从54.83%骤降至3.97%,兼性产甲烷菌甲烷八叠球菌(Methanosarcina)丰度从1.29%升高至42.71%,这可能是由于油脂抑制乙酸营养型路径中利用乙酰辅酶A合酶(EC:6.2.1.1)产生乙酰辅酶A的路径,促进利用乙酸激酶(EC:2.7.2.1)和磷酸转乙酰酶(EC:2.3.1.8)的路径引起的,从而维持了此时的乙酸降解活性。此外,氢营养型产甲烷菌甲烷螺旋菌(Methanospirillum)的相对丰度从0%含油率时的13.50%升高至含油率8%时的51.67%,说明含油率的升高使得系统利用氢气能力增强,因此增强了氢活性。(4)对运行过程中TMP的监测表明,当含油率从0%增加至8%时,膜污染速率增加了10倍,膜阻力升高了24.85%,且泥饼层阻力占比达到84.09%。三维荧光光谱、傅里叶红外光谱以及CLSM结果显示,膜表面主要污染物为蛋白质类和多糖类物质,且污染深入膜孔隙中,而微生物主要存在于膜表面泥饼层中。油脂对膜污染影响的机制为,油脂由于具有黏附作用和对微生selleckchem物的抑制作用等,引起TS、VS以及SMP、LB-EPS浓度的升高,从而导致污泥粒径变大,使得形成的泥饼层更加致密厚实;并且SMP、LB-EPS以及膜表面泥饼层中的高蛋白质/多糖会进一步提升膜污染风险,从而加剧膜污染。

目的：探讨lncRNA端粒酶RNA组分（Terc）在心肌纤维化（MF）过程中的作用。方法：使用不同浓度的TGF-β1诱导心肌成纤维细胞（CFs）转分化，通过免疫荧光染色、western blot检测α-SMA、VimeAnti-cancer medicinesntin、Collagen I、Collagen III蛋白的表达水平，qRT-PCR检测lncRNA Terc表达水平。过表达和敲减Terc后，通过western blot、CCK-8和流式细胞术观察模型细胞的胞外基质产生、细胞增殖、凋亡和Smads信号传导情况。皮下注射异丙肾上腺素（ISO）构建小鼠心肌纤维化模型，并使用Terc敲低慢病毒干预，其后多普勒超声仪检测小鼠的心脏射血分数（EF）和左室短轴缩短率（FS），称量小鼠心脏湿重，HE、Masson染色检测小鼠心脏的病理改变，IHC检测α-SMA、Vimentin蛋白的表达水平，qRT-PCR检测lncRNA Terc表达水平。结果：TGF-β1处理增加CFs的α-SMA、Vimentin、Collagen I、Collagen III的蛋白表达以及Terc水平；过表达Terc促进α-SMA、Vimentin、Collagen I、Collagen IMS-275配制II的蛋白表达以及Smad2/3的磷酸化水平，同时还可促进CFs的增殖、抑制CFs的凋亡；敲减Terc则起相反的作用；动物模型中，ISO可抑制EF和FS，增加心脏湿重，加重心肌的病理损伤，而敲减Terc可有效缓解上述过程。结论：LncRNA Terc可通过促进Smads信号传导，加速心肌成纤维细胞转Smoothened Agonist分化和心肌纤维化进展。

目的探讨使用蒽环类药物化疗的淋巴瘤患者心脏毒性的发生情况及临床特点,同时探讨蒽环类化疗药物致淋巴瘤患者心脏毒性的危险因素,进一步分析化疗期间超敏肌钙蛋白T(hs-c Tn T)及心电图异常次数对心脏毒性的诊断价值。方法回顾性收集甘肃省人民医院电子病案系统2016年1月至2022年10月肿瘤内科及血液科经病理活检确诊为淋巴瘤并符合纳购买AZD2281排标准的患者251例,按化疗后是否出现心脏毒性分为心脏毒性组(n=51)点击此处和无心脏毒性组(n=200)。收集入组患者的基线资料、心肌酶学指标、生化指标等,通过二元logistic回归分析方法探讨可能引起心脏毒性的影响因素;进一步采用受试者工作曲线(ROC)分析hs-c Tn T及心电图异常次数对心脏Molecular cytogenetics毒性的诊断价值。结果(1)发生心电图异常者125例,发生率为49.8%,其中最主要的心电图异常为ST-T改变,发生率48.6%。(2)发生慢性心脏毒性者有51例,发生率为20.31%。(3)发生慢性心脏毒性的多因素logistic回归分析表明,年龄、性别、心电图异常次数≥5次、蒽环类药物累积剂量、hs-c Tn T异常是发生慢性心脏毒性的独立危险因素(P<0.05);进一步分析得出年龄、蒽环类累积剂量与LVEF值呈明显正相关(P<0.05)。(4)ROC曲线结果表明hs-c Tn T诊断慢性心脏毒性的AUC值为0.731,敏感度为76.5%,特异度为66.5%;心电图异常次数尚不能预测慢性心脏毒性发生的作用。结论(1)蒽环类药物化疗期间心电图异常的发生率为49.8%,以ST-T改变为主。(2)化疗期间出现心脏毒性者有51例,发生率为20.31%。(3)年龄、性别、心电图异常次数、hs-c Tn T异常、蒽环类累积剂量等是发生心脏毒性的独立危险因素,且年龄、蒽环类药物累积剂量与LVEF值呈明显正相关。(4)hs-c Tn T对心脏毒性有一定诊断价值。

目的 探讨基于捕获法的靶向测序技术在弥漫大B细胞淋巴瘤IgH基Pidnarulex供应商因克AG-221供应商隆性重排检测中的应用价值。方法 收集2020年3月～2022年1月苏州大学附属第一医院送检的DLBCL标本99例，提取患者基因组DNA,使用基于捕获法的靶向测序技术进行IgH基因Quality us of medicines克隆性重排检测。结果 27.3%(27/99)患者检测到IgH基因完全IgHV-IgHD-IgHJ重排，50.5%(50/99)患者检测到IgH基因不完全IgHD-IgHJ重排，IgH基因克隆性重排联合检出率为66.7%(66/99)。27例患者检测到32种IgHV-IgHD-IgHJ重排，50例患者检测到52种IgHD-IgHJ重排，在IgHV-IgHD-IgHJ重排中，IgHV3、IgHD3和IgHJ4家族基因的取用频率最高，在IgHD-IgHJ重排中，IgHD3和IgHJ4家族基因的取用频率最高。3例患者捕获到未知IgH基因融合伴侣，其中2例为MIR4507-IgH融合，1例为IRF8-IgH融合。结论 基于捕获法的靶向测序技术不仅可以检测IgH基因克隆性重排具体方式，还能发现IgH基因未知融合伴侣，对DLBCL诊断及个体化治疗策略制定具有重要意义。

研究目的:胃癌是全球最常见的消化道恶性肿瘤之一,肿瘤的侵袭、转移和血管新生是导致患者病情迅速恶化的重要原因。近年来肿瘤微环境(tumor environment,TME)成为胃癌研究领域的热点,研究表明,TME中的肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages,TAMs)在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用。巨噬细胞在人体各处局部微环境中表现出明显异质性,根据巨噬细胞表面标志物及产生的细胞因子可分为两大亚群——M1/M2型巨噬细胞。而外泌体在肿瘤微环境中发New microbes and new infections挥了衔接周围细胞与肿瘤细胞间信号传递和物质传送的重要作用。滋阴化痰方是长征医院中医科针对晚期胃癌创制的有效方药,临床可提高患者生存质量、延长生存期,前期实验研究显示滋阴化痰方对于胃癌细胞增殖和血管新生具有抑制作用,但其具体作用机制尚不清楚。本研究拟通过一系列体内外实验,探索滋阴化痰方是否能够通过调控巨噬细胞极化从而抑制胃癌血管新生,并且www.selleck.cn/products/VX-765研究外泌体是否在其中起到关键调节作用,进而揭示其可能的调控机制,为阐明有效方药治疗胃癌的科学原理提供数据支持。研究方法:首先我们建立胃癌细胞MFC(Mouse Fore-stomach Carcinoma Cell)荷瘤小鼠皮下移植瘤模型,将615小鼠分为对照组、滋阴化痰方低、中、高剂量组、巨噬细胞清除剂组和滋阴化痰方高剂量联合巨噬细胞清除剂组。1、利用免疫组化和免疫荧光实验观察滋阴化痰方对荷瘤小鼠瘤体组织微血管密度(microvessel density,MVD)的影响。2、通过细胞因子抗体芯片检测荷瘤小鼠血液免疫相关细胞因子的表达情况,并筛选其中与巨噬细胞极化相关的细胞因子。3、通过流式细胞术、免疫组化和免疫荧光实验观察滋阴化痰方对荷瘤小鼠血液、瘤体组织中M2型巨噬细胞表达的影响。通过以上动物实验观察滋阴化痰方抑制胃癌血管新生的作用是否与调控巨噬细胞有关。其次本研究采用小鼠骨髓来源巨噬细胞(Bone Marrow Derived MacroNirmatrelvir核磁phages,BMDMs)、巨噬细胞系RAW264.7作为研究对象。为探究滋阴化痰方调控巨噬细胞极化的分子机制,采用WB(Western blot)和q-PCR等方法检测滋阴化痰方作用于M2型BMDMs和RAW264.7后,STAT3、PPAR-γ、SOCS1、STAT1、JAK2和SOCS3等芯片分析及查阅文献筛选出的潜在作用靶点的表达情况。接着通过以下实验探索巨噬细胞分泌的外泌体是否参与调控胃癌细胞侵袭、迁移和血管新生。我们设立对照组、M2型BMDMs上清液组、外泌体抑制剂GW4869组、M2型BMDMs+GW4869上清液组和M2型BMDMs分泌外泌体组,运用WB、ELISA、Transwell的方法检测各组对鼠源胃癌细胞MFC和人源胃癌细胞MKN-45及细胞上清中血管新生相关因子VEGFA、VEGFC、VEGFR2和b FGF表达水平。最后为探索滋阴化痰方是否调控巨噬细胞分泌的外泌体抑制胃癌血管新生,我们将滋阴化痰方作用于M2型BMDMs后提取上清液中的外泌体。运用Transwell实验观察其对胃癌细胞迁移和侵袭的影响。通过HUVECs(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,人脐静脉内皮细胞)管腔形成实验,观察其与胃癌细胞共培养后提取的细胞上清对HUVECs形成管腔能力的影响。运用WB、ELISA和q-PCR的方法观察其对胃癌细胞分泌VEGFA、VEGFC、VEGFR2和b FGF及蛋白、m RNA表达水平的影响。运用WB的方法检测滋阴化痰方作用于M2型BMDMs所提取外泌体作用胃癌细胞后,VEGF基因转录相关的NF-κB信号通路上p-65、IκBα、My D88等相关蛋白的表达。结果:首先免疫组化、免疫荧光实验结果表明,滋阴化痰方组荷瘤小鼠瘤体微血管密度下降,且呈剂量依赖性。细胞因子抗体芯片分析表明,与对照组相比,滋阴化痰方组荷瘤小鼠外周血中IL-6、TNF-α、IL-1β等与M1型巨噬细胞相关的促炎因子表达水平显著上升,TGF-β1、IL-10等与M2型巨噬细胞相关的抗炎因子表达水平显著下降。流式细胞术、免疫组化、免疫荧光实验显示,滋阴化痰方降低了荷瘤小鼠瘤体组织中M0型巨噬细胞标志物F4/80和M2型巨噬细胞标志物CD206的表达水平。体内实验表明滋阴化痰方抑制胃癌血管新生的作用可能与调控巨噬细胞有关。其次WB和q-PCR的结果显示,与对照组相比,滋阴化痰方组M2型巨噬细胞中的STAT1、JAK2和SOCS3的表达水平升高,而STAT3、PPAR-γ和SOCS1的表达受到了抑制,初步探讨了滋阴化痰方调控巨噬细胞极化的分子机制。接着WB、ELISA和Transwell的结果显示,M2型BMDMs的细胞上清可上调胃癌细胞中VEGFA、VEGFC、VEGFR2和b FGF的表达,其中M2型BMDMs细胞上清分泌的外泌体起主要促进作用。最后Transwell实验结果表明,滋阴化痰方作用于M2型BMDMs后提取的外泌体可抑制胃癌MFC和MKN-45细胞的迁移和侵袭,且呈剂量依赖性。HUVECs管腔形成实验证明,其可明显抑制HUVECs的管腔形成能力。WB、ELISA和q-PCR的实验结果表明,滋阴化痰方能降低MFC和MKN-45细胞及细胞上清中VEGFA、VEGFC、VEGFR2和b FGF表达。WB结果显示,滋阴化痰方干预M2型BMDMs提取的外泌体能抑制胃癌细胞MFC和MKN-45中p-65、My D88的表达,上调IκBα的表达。证实了外泌体是滋阴化痰方调控巨噬细胞极化抑制胃癌血管新生的关键调控者。结论:1.巨噬细胞向M2极化在胃癌发生发展中发挥重要作用,体内外实验证实滋阴化痰方可抑制巨噬细胞向M2极化,其机制可能与抑制SOCS1/STAT3/PPAR-γ通路,激活STAT1/JAK2/SOCS3通路有关。2.巨噬细胞分泌的外泌体可促进胃癌细胞的迁移、转移及血管新生,滋阴化痰方可通过抑制巨噬细胞向M2极化发挥其抗胃癌侵袭、转移及血管新生作用,其作用机制与巨噬细胞分泌的外泌体有关。

研究目的:由于全球人口老龄化、肥胖、不健康的饮食习惯以及久坐生活方式的发展,糖尿病及其并发症迅速发展。据国际糖尿病联合会(International Diabetes Federation,IDF)估计,2021年全球有5.37亿成年人(20-79岁)患有糖尿病,预计到2030年,这一数字将上升到6.43亿,到2045年将上升到7.83亿。在所有糖尿病中,2型糖尿病(Type 2 diabetes,T2DM)患者占90%以上,T2DM是一种慢性代谢性疾病,它的主要特征是由胰岛β细胞功能障碍和胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)引起的胰岛素相对缺乏。胰岛素的主要作用是促进骨骼肌、肝脏和脂肪等组织中营养的吸收和储存,IR主要表现为骨骼肌、肝脏和脂肪等组织对葡萄糖的摄取受损,从而破坏全身葡萄糖稳态,导致高血糖和高脂血症,进而导致了许多如微血管疾病(糖尿病肾病,糖尿病视网膜病变和糖尿病足)和大血管疾病(中风,心脏病)等T2DM相关的并发症,这些并发症给医疗保健系统带来了巨大的压力。Sestrin2是哺乳动物中Sestrins蛋白质家族Brain-gut-microbiota axis的成员之一,曾被命名为Hi95,它在长期缺氧、DNA损伤或氧化应激状态下被激活,对细胞具有保护作用。Sestrin2主要受肿瘤抑制因子P53调控,p53是一种应激激活的转录因子,介导Sestrin2激活AMPK、抑制mTORC1,从而抑制细胞增殖或诱导细胞死亡。此外,Sestrin2还参与各种缺氧相关疾病,如脑缺氧疾病、心肌缺氧疾病、缺氧相关呼吸系统疾病和糖尿病等。研究发现,Sestrin2与2型糖尿病密切相关,Sestrin2敲除后,肥胖诱导的小鼠葡萄糖不耐受、胰岛素抵抗和炎症反应加剧。Sestrin2过表达可通过增加胰岛素敏感性、抑制氧化应激应激、促进线粒体自噬、抑制炎症反应等多条通路,参与调控T2DM的发病进程。研究表明,Sestrin2水平与糖尿病患者的冠心病、糖尿病肾病高度相关,在糖尿病冠心病或糖尿病肾病患者血清中,Sestrin2水平显着降低,血清Sestrin2水平低与糖尿病冠心病风险增加有关。然而,另有研究表明,在喂食高脂肪饮食的大鼠肝脏中Sestrin2的表达上调,在代谢综合征受试者特别是在2型糖尿病患者中Sestrin2水平呈增加的趋势,且Sestrin2浓度与胰岛素抵抗呈显著正相关。因此,Sestrin2参与调控T2DM的机制仍存在争议。骨骼肌是人类负责维持正常葡萄糖稳态的最大胰岛素反应器官,骨骼肌代谢功能障碍会导致胰岛素抵抗,骨骼肌胰岛素抵抗被认为是T2DM发病机制的主要驱动因素,讨论骨骼肌胰岛素抵抗对T2DM的防治意义重大。因此本研究以C2C12肌管为实验对象,用棕榈酸(Palmitic acid,PA)诱导C2C12肌管胰岛素抵抗模型,通过免疫荧光、油红O染色、Werstern blot,观察Sestrin2的蛋白表达情况,从而探究Sestrin2在骨骼肌胰岛素抵抗发病机制中的作用,以期为T2DM的靶向治疗提供更多的理论据。研究方法:(1)细胞传代培养当C2C12小鼠成肌细胞生长至80%-90%融合时进行传代,弃掉废液,加入1ml胰酶消化2min左右,待细胞收缩变圆时加入3ml培养基终止消化,用吸管将贴壁细胞吹打下来,并转入15ml离心管内,1000rpm,离心时间5min,弃上清后用1-2ml含10%胎牛血清和1%青链霉素的完全培养液重悬细胞,摇晃均匀,以1:3接种至提前加入适当完全培养基的培养皿以扩大培养。(2)诱导分化C2CSB431542作用12小鼠成肌细胞细胞生长至70-80%融合时,以3*105每孔的密度接种到六孔板上,每孔加2ml培养基,置于37℃,5%C点击此处O2细胞培养孵育箱中孵育,培养24h,使贴壁细胞形成单层细胞。当融合度达到80%左右时将培养液换为含有2%马血清和1%青链霉素的高糖DMEM分化液,每两天换一次液,4-7天形成大量肌管后,用于后续实验。(3)棕榈酸诱导IR模型分化4-7天后,实验组用0.6mM棕榈酸孵育C2C12肌管细胞16h,制造肌管细胞胰岛素抵抗模型,用2%BSA的高糖DMEM培养基作为对照培养。(4)实验分组NC组为正常对照组,PA组为胰岛素抵抗模型组(5)实验方法通过葡萄糖含量检测试剂盒测定上清液葡萄糖摄取量、油红O染色测定脂质沉积、ROS含量检测试剂盒测定氧化应激反应、Western blot(WB)测定IRS-1和GLUT4蛋白表达,验证胰岛素抵抗造模是否成功。用Western blot测定Sestrin2蛋白的表达情况。(6)数据分析所有实验结果用均数±标准差(x±SD)表示,使用SPSS 22.0软件对实验数据进行分析处理,主要采用的统计学方法为组内比较使用配对样本T检验,组间样本比较使用独立样本T检验,以P<0.05表示差异具有统计学意义,P<0.01表示差异极具有统计学意义,利用ImageJ软件进行WB蛋白条带进行分析。研究结果:2%马血清诱导肌管形成(如图1所示)(1)与NC组相比,PA组的脂质沉积明显(如图2所示);葡萄糖摄取量显著下降((P=0.034<0.05);IRS-1(P=0.004<0.01)蛋白含量和GLUT4(P=0.016<0.05)蛋白含量显著下降;说明棕榈酸诱导的C2C12肌管胰岛素抵抗造模成功。(2)NC组相比,PA组的ROS明显升高,出现氧化应激反应(如图3所示);(5)与对照组相比,实验组Sestrin2蛋白的表达显著上升(P=0.019<0.05)。研究结论:在骨骼肌胰岛素抵抗个体中,胰岛素信号通路受损,ROS明显升高,Sestrin2基因表达显著上调。Sestrin2水平的增加可能源于一种代偿机制,棕榈酸诱导的氧化应激反应诱导Sestrin2表达上调,从而代偿性保护机体免受侵害。未来展望:本研究存在一定局限性,目前的数据只能单方面证明骨骼肌胰岛素抵抗可能会导致Sestrin2表达上升,但不能明确它们两者因果关系,因此下一步的研究可以通过沉默Sestrin2来确认Sestrin2是否会导致骨骼肌胰岛素抵抗,或通过过表达Sestrin2来确认Sestrin2是否具有改善骨骼肌胰岛素抵抗的潜力。另外,有研究表明,运动后骨骼肌中Sestrin2表达显著增加,但运动介导Sestrin2的上调是否足以改善骨骼肌胰岛素抵抗仍不明确。因此未来有必要进一步探究运动是否以及如何通过介导Sestrin2调控骨骼肌胰岛素抵抗,从而靶向治疗T2DM。