PI3K抑制剂

水稻产量大部分来自于叶片的光合作用,而光合作用的进行依赖于叶绿体的正常发育。叶绿体是半自主性细胞器,通常被认为是光合细菌内共生而来。在内共生过程中,大多数原核生物基因组丢失或转移到核基因组中,因此,大部分叶绿体蛋白是由核基因编码的。只有当叶绿体蛋白转运至特定的功能位点并发挥其功能,才能进一步进行光合作用供植物生长发育。首先核编码的叶绿体蛋白由叶绿体内外膜上的复合物转运至叶绿体中,其次通过不同的转运途径运输至类囊体中发挥功能。因此,对叶绿体发育和叶绿体蛋白转运机制的研究,有助于深入了解水稻光合作用调控机制,为进一步培育高产水稻奠定基础。本研究通过一个叶片黄化突变体yll1(yellow leaf andlethal 1)克隆到目的基因OsALB3(ALBINO3),并对OsALB3的功能进行初步的研究。主要结论如下:1.突变体yll1是从经甲基磺酸乙酯(EMS)诱变的粳稻品种日本晴后代获得。yll1苗期叶片为淡黄色,生长24天左右死亡。突变体yll1中的叶绿素a和叶绿素b的含量均显著低于野生型。通过透射电镜观察到,突变体yll1中的叶绿体结构异常,类囊体膜数量大量减少。2.遗传分析表明,突变体yll1叶片黄化性状是受一对隐性核基因控制。选取同一家系中30株野生型与突变体yNeuropathological alterationsll1的DNA等比例混合,分别进行高通量测序分析,并将有效的样本数据通过MutMap+技术筛选,根据突变体池中SNP/Indel-index=1和野生型池中SNP/Indel-index<0.5的特定规则,最后获得唯一候选目的基因LOC_O更多s01g05800。3.突变体yll1中LOC_Os01g05800基因发生单碱基替换,由C突变成T,导致编码的第140位氨基酸由丙氨酸(Ala)突变为缬氨酸(Val)。根据水稻基因组注释LOC_Os01g05800与拟南芥中的内膜蛋白编码基因ALBINO3相似,因此,我们将该基因命名为OsALB3。OsALB3包含12个外显子,在其中间部位含有一个60Kd的内膜蛋白结构域。BLAST可以发现OsALB3在植物、动物、真菌和细菌中均存在同源物。多重序列比对分析显示,在不同物种间的ALB3同源蛋白在60Kd内膜蛋白结构域之间高度保守。利用CRISPR/Cas9系统编辑OsALB3基因,得到目的基因敲除突变体,其表型与突变体yll1一致,进一步证明OsALB3(LOC_Os01g05800)的突变是致使水稻叶片黄化基因。4.OsALB3基因表达模式分析表明该基因在水稻各组织均有表达,且在叶中表达量较高。亚细胞定位结果显示,OsALB3蛋白定位在叶绿体。5.拟南芥中MLN8237体内的研究结果表明,在叶绿体信号识别粒子途径中,ALBINO3主要负责将捕光叶绿素结合蛋白整合至类囊体膜上,从而进一步参与光合作用。因此,本研究通过Western-Blot实验分析相关色素蛋白在yll1中的表达量是否发生变化,结果表明光系统Ⅰ(PS Ⅰ)的捕光色素蛋白Lhca1、Lhca2、Lhca3和Lhca4和光系统Ⅱ(PSⅡ)的捕光色素蛋白Lhcb1、Lhcb2、Lhcb4和Lhcb5的含量在突变体yll1中大量减少。因此OsALB3对捕光叶绿素结合蛋白的积累具有重要作用。本研究结果为进一步对叶绿体蛋白的运输机制提供参考,为调控水稻光合作用奠定基础。

近年来,磷酸三苯酯(Triphenyl phosphate,TPHP)及其肝脏代谢产物磷酸二苯酯(Diphenyl phosphate,DPHP)、全氟辛烷磺酸(Perfluorooctane sulfonic acid,PFOS)及其替代品全氟壬烯氧基苯磺酸钠(Sodiumρ-perfluorous nonenoxybenzene sulfonate,OBS)是环境介质及人体中最常检出的有机磷酸酯(Organophosphate esters,OPEsAlpelisib临床试验)和全(多)氟烷基化合物(Per-and poly-fluoroalkyl substances,PFASs)。已有研intensive lifestyle medicine究表明,肝脏是OPEs及PFASs的主要富集或代谢器官,但目前OPEs及PFASs对肝细胞的毒性效应和分子机制的相关研究还很匮乏。本实验以人正常肝细胞(L02)为实验对象,从细胞水平研究TPHP、DPHP、PFOS及OBS对肝细胞的损害,并通过转录组测序(RNA sequence,RNA-seq)全面分析并比较目标污染物对肝细胞造成的系统毒性。此外,在活体水平上验证了TPHP对selleck Z-VAD-FMK肝脏的毒性及机制。研究得出如下主要结论:(1)TPHP比DPHP表现出更强的肝细胞毒性。胰岛素抵抗是TPHP引起肝细胞最显著的毒性之一,TPHP暴露后能够显著降低胰岛素刺激下的葡萄糖摄取与糖原合成,并且使内质网应激标志基因的m RNA显著上调,而DPHP暴露后没有显著变化。内质网应激的特异性抑制剂4-苯基丁酸(4-Phenylbutyric acid,4-PBA)可明显逆转TPHP引起的毒性效应。与DPHP相比,TPHP暴露可通过内质网应激诱导更强的胰岛素抵抗。(2)高浓度(80 mg/kg)的TPHP能够显著降低C57BL/6J小鼠体重及肝糖原的含量,并且导致小鼠餐后血糖显著上升,干扰机体内的糖代谢;同时TPHP暴露可引起实验小鼠肝脏的内质网应激相关基因m RNA显著上调。添加4-PBA后会逆转TPHP暴露引起的毒性效应,所以TPHP暴露能够诱导小鼠肝脏内质网应激和胰岛素抵抗。(3)OBS具有与PFOS不完全相同的肝细胞毒性机制。PFOS和OBS诱导的肝细胞毒性分别集中在类固醇合成和ECM-受体相互作用等相关通路,PFOS暴露后胆固醇(Total Cholesterol,TC)水平显著下降,而OBS暴露后细胞外基质标志基因m RNA水平显著升高。OBS比PFOS造成的L02细胞凋亡、铁死亡水平以及促炎细胞因子的含量更高。这些均表明OBS具有比PFOS更强的肝细胞毒性,并不是理想的PFOS替代品。

目的:评估视网膜分支静脉阻塞(branch retinal vein occlusion,BRVO)继发黄斑水肿(macular edema,ME)患者接受玻璃体腔内注射雷珠单抗后黄斑区视网膜神经节细胞复合体(ganglion cell complex,GCC)及视盘周围神经纤维层(retinal nerve fiber layer,RNFL)的变化。方法:回顾性分析2021年5月-2022年12月大连市中心医院眼科就诊被确诊BRVOME的患者,对符合纳入标准的25人(25眼)设为实验组。选取同期于我科就诊的年龄、性别相当的无相关性眼病的健康人共30人(30眼)设为对照组。所有实验组患者均采用“3+PRN”方案(即前三个月每月注药一次,后续按需治疗)进行玻璃体腔内注射雷珠单抗。使用频域光学相干断层扫描成像(spectral-domain optical coherence tomography,SD-OCT)采集黄斑及视盘数据。黄斑区图像由仪器自带分析软件自动定义将黄斑区分为3个同心圆,4个象限,共形成9个分区(如图3)。本研究将9个分区合并为(如图4)黄斑中心凹(macular fovea,M0)、中心凹上方(macular superior,MS)、中心凹鼻侧(macular nasal,MN)、中心凹下方(macular inferior,MI)、中心凹颞侧(macular temporal,MT)。视盘区图像由仪器自带分析软件自动分为4个象限(如图1、图2):上方(superior,S)、鼻侧(nasal,N)、下方(inferior,I)和颞侧(temporal,T)。实验组(25眼)按照阻塞部位将颞下分支静脉阻塞患者设为A组(15眼)、将颞上分支静脉阻塞患者设为B组(10眼),分析对比注射前后的A、B组、正常对照组的黄斑区GCC厚度变化。分析对比注射前后的实验组、正常对照组的视盘周围RNFL厚度selleck LGX818变化。结果:1、黄斑区GCC变化:1.1两组患者注射前各个区均比对照组厚,差异具有统计学意义(P<0.05)。各个区注射1、2、3针后与注射前相比GCC厚度均下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。1.2 A组(下颞Human biomonitoring区BRVO)的M0、MS、MN区及B组(上颞区BRVO)的M0、MN区注射2针后与对照组相比,GCC厚度差异无统计学意义(P>0.05)。1.3 A组(下颞区BRVO)的MI、MT区及B组(上颞区BRVO)的MS、MT区注射3针后GCC厚度仍高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。1.4 A组(下颞区BRVO)的MS、MN区及B组(上颞区BRVO)的M0、MN区注射3针后与对照组相比GCC厚度有变薄的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。2、视盘周围RNFL厚度变化:2.1实验组注射前与对照组相比RNFL厚度差异无统计学意义(P>0.05)。2.2实验组注射3针后视盘周围RNFL各个象限与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。2.3实验组注射3针后较治疗前相比视盘周围RNFL厚度有下降的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1、BRVO-ME患者黄斑区GCC厚度较正常人显著增厚。2、玻璃体腔内注射雷珠单抗可快速降低BRVO-ME患者黄斑区GCC厚度,有助于恢复GCC结构。3、玻璃体腔内注射雷珠单抗后黄斑区GC确认细节C厚度的下降程度与BRVO发生的解剖位置相关,非病变区雷珠单抗注射2针后GCC已基本恢复正常。4、BRVO病变发生区域的GCC厚度在雷珠单抗注射3针后仍未恢复正常,提示继续治疗的必要性。5、雷珠单抗注射3针后GCC的厚度(非病变发生区域)及视盘周围RNFL厚度有变薄的趋势,但差异无统计学意义,提示雷珠单抗短期内对视网膜内层结构无显著负面影响。

莲雾（Syzygium samarangense）因其含有多糖、有机酸、类黄酮、矿物质等功能活性成分而具有很高的营养和药用价值，受到越来越多研究者的关注。本研究从莲雾中分离出水溶性多糖（WAP），并在人肝细胞（L02细胞）中评估了其对氨基甲酸乙酯（EC）诱导的氧化损伤的保护作用。首先采用高效液相色谱法（HPLC）、高效凝胶渗透色谱（HPGPC）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、气相色谱/质谱（GC/MS）、~1H和~(13)C核磁共振（NMR）等一系列分析方法来鉴定WAP的结构。随后进行体外细胞实验验证WAP对EC诱导的L02细胞中的细胞毒性、遗传毒性和氧化损伤的保护作用。结果表明，莲雾的WAP由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和岩藻糖组成，其摩尔比为2.20:3.94:4.45:8.56:8.86:30.82:39.78:1.48。结合甲基化和NMR光谱分析，WAP的一级结构为Araf-(1→、Glcp-(1→、→2)-ZD1839小鼠AGPCR & G Protein抑制剂raf-(1→、→3)-Galp-(1→、→3)-Araf-(1→和→6)-Galp-(1→。体外细胞实验表明，WAP通过抑制细胞毒性和遗传毒性，减少活性氧（ROS）和超氧根离子（O_2~(·-)）的形成，对EC诱导的L02细胞表现出显著的保护作用。综上所述，WAP具有作为肝脏氧化损伤的重要治疗剂Human hepatic carcinoma cell或补充剂的潜力，但仍需通过体内生物学和临床研究进一步证实上述作用。

研究背景与目的脓毒症是一种由感染引起的潜在致命的器官功能障碍性疾病。作为一种高致死率的疾病,脓毒症可导致细胞功能障碍,最终引起器官衰竭。肝脏是人体重要的免疫监视器官,由于常暴露于各种有害因素下,还容易成为脓毒症相关损伤的靶点。肝功能障碍是脓毒症的早期表现,也是脓毒症死亡率的独立预测指标。铁死亡是最常见和最古老的细胞死亡形式之一,其特征是不受控制的脂质过氧化。目前研究表明,铁死亡可以出现在各种肝脏疾病中,抑制铁死亡Telaglenastat使用方法可以减轻肝脏的损伤。大多数细胞表面受体属于G蛋白偶联受体(GPCR)家族,由于可以识别广泛的细胞外分子,参与许多生理和病理过程,GPCRs成为极具潜力的药物研究靶点。G蛋白偶联受体116(GPR116/ADGRF5)是黏附G蛋白偶联受体家族的成员,具有调节肺泡表面活性物质含量、参与肾脏酸分泌、增加胰岛素对白色脂肪组织的敏感性等功能。但其在脓毒症相关肝损伤中的作用尚未被报道。本研究旨在阐明GPR116在脓毒症相关肝损伤Baf-A1发生发展中的作用和机制,以及与铁死亡的关联,为脓毒症相关肝损伤的防治提供潜在的生物标志物和治疗靶点。研究方法1.体内实验(1)GPR116在脓毒症肝损伤中表达变化的研究选择雄性C57BL/6小鼠(8～12周,20～25 g,无特殊病原)随机分成2组:对照组和实验组,所有小鼠均喂食标准的食物和水,并在使用前使其适应环境。使用七氟醚麻醉小鼠,实验组小鼠用23号针建立盲肠结扎和穿刺(CLP)引起的脓毒症模型,对照组小鼠单纯开腹而不做盲肠结扎手术。在不同的时间点(0h、24h、48h)麻醉小鼠,心脏取血后处死小鼠,同时收集肝脏组织。利用全自动生化分析仪检测血清中的谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)、谷草转氨酶(aspertate aminotransferase,AST)的水平,同时利用不同的生化试剂盒检测肝脏组织中的丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)、水平。H&E染色观察肝脏损伤情况,透射电镜观察肝脏线粒体损伤情况。Western Blot法检测肝脏组织中GPR116和GPX4等蛋白的表达情况。(2)GPR116在脓毒症小鼠肝损伤中作用及机制的研究构建GPR116肝细胞特异性敲除小鼠(GPR116~(fl/fl)Alb~(cre-/-)小鼠)。8～12周雄性GPR116~(fl/fl)Alb~(cre+/+)和GPR116~(fl/fl)Alb~(cre-/-)小鼠(20～25 g)随机分为:GPR116~(fl/fl)Alb~(cre+/+)+SHAM组、GPR116~(fl/fl)Alb~(cre+/+)+CLP组、GPR116~(fl/fl)Alb~(cre-/-)+SHAM组、GPR116~(fl/fl)Alb~(cre-/-)+CLP组,模型建立方法如前所述,所有小鼠均喂食标准的食物和水,并在使用前使其适应环境。48h后,麻醉小鼠,心脏取血后处死小鼠,同时收集肝脏组织,在此期间记录48h生存率。利用全自动生化分析仪检测血清中的谷丙转氨酶、谷草转氨酶的水平,利用不同的生化试剂盒检测肝脏组织中的丙二醛、谷胱甘肽(glutathione,GSH)的水平。H&E染色观察肝脏损伤情况,透射电镜观察肝脏线粒体损伤情况。Western Blot法检测肝脏组织中GPR116、GPX4、SLC7A11、SLC3A2的表达情况。免疫组化染色法检测4-羟基壬烯醛(4-Hydro-xynonenal,4-HNE)的表达情况。使用铁死亡抑制剂Liproxstatin-1处理小鼠,检测4-HNE、ALT、AST和肝组织H&E染色,验证铁死亡在脓毒症肝损伤中的重要作用。2.体外实验:验证GPR116在脓毒症小鼠肝损伤中的作用机制体外培养小鼠肝细胞(AML12 cells),消化细胞,并按50～70%的密度接种到6孔板,37℃、5%CO_2、95%空气的恒温培养箱孵育过夜,第二天换液之后将GPR116进行高表达或干扰处理。当细胞密度达到70%～80%时加入Erastin 10μmol刺激24h后收集细胞。结果1.GPR116在脓毒症小鼠的肝组织中表达上调CLP后,与SHAM组相比,CLP组的小鼠肝脏中GPR116的表达显著上调,峰值出现在48 h。CLP造模后也可观察到肝组织出现铁死亡。提示GPR116有可能参与脓毒症肝损伤的发生发展过程。2.肝细胞特异性缺失GPR116的脓毒症小鼠肝损伤减轻CLP后,与GPR116~(fl/fl)Alb~(cre+/+)小鼠相比,肝细胞特异性缺失GPR116(GPR116~(fl/fl)Alb~(cre-/-))的小鼠肝损伤减轻,死亡率也显著下降。说明肝细胞特异性缺失GPR116的脓毒症小鼠肝损伤减轻,肝细胞GPR116可能促进了脓毒症肝损伤进展。3.GPR116通过抑制System Xc~-/GSH/GPX4通路,促进肝脏铁死亡,加重肝损伤CLP后,GPR116~(fl/fl)Alb~(cre-/-)小鼠肝脏组织中铁死亡相关蛋白(GPX4、SLC7A11、SLC3A2)的表达增加;而GPR116~(fl/fl)Alb~(cre+/+)则出现了相反的结果。说明GPR116通过抑制System Xc~-/GSH/GPX4通路,促进肝脏铁死亡,从而加重了肝损伤。4.GPR116加重Erastin刺激的AML12细胞的损伤GPR116 si-RNA干扰,Erastin(一种铁死亡激动剂)处理AML12细胞后,与对照组相比,GPR116干扰组细胞死亡率更低;而GPR116高表达处理,Erastin刺激细胞后,与对照组相比,GPR116高表达组细胞死亡率更高。说明GPR116加重了Erastin刺激的AML12细胞的损伤。5.GPR116通过抑制system Xc~-/GSH/GPX4通路,促进AML12细胞的铁死亡GPR116干扰,Erastin处理AML12细胞后,与对照组相比,GPR116干扰组铁死亡相关蛋白(GPX4、SLC7A11、SLC3A2)的表达增加;而GPR116高表达处理,Erastin刺激细胞后,与对照组相比,GPR116高表达组铁死亡相关蛋白表达降低。说明GPR116通过抑制System Xc~-/GSH/GPX4通foetal immune response路,促进AML12细胞铁死亡。结论在脓毒症肝损伤中,GPR116在肝组织的表达增加,并通过抑制System Xc~-/GSH/GPX4通路,促进铁死亡的发生,加重肝组织损伤。

试验旨在研究低鱼粉高脂饲料中添加大豆卵磷脂对黄鳝(Monopterus albus)生长、血清生化指标及肠道菌群的影响,为降低黄鳝鱼粉使用量提供依据。以初始体重(20.03±0.01Baf-A1半抑制浓度) g黄鳝为研究对象,以含有42%鱼粉、22%豆粕、6%粗脂肪的饲料为正常鱼粉组,另以含有22%鱼粉、52%豆粕和9%粗脂肪的饲料为低鱼粉高脂组,分别在低鱼粉高脂组中添加1%和2%的大豆卵磷脂,进行为期56d的养殖试验,于室外池塘进行网箱养殖,日投喂1次,喂量为黄鳝体重3%—5%。结果表明:(1)与对照组相比,低鱼粉高脂组黄鳝增重率显著降低(P<0.05),饵料系数与肝体比均显著增加(P<0.05),但添加2%大豆卵磷脂后黄鳝增重率显著提高(P<0.05),而饵料系数与肝体比显著降低(P<0.05);(2)对比正常鱼粉组,低鱼粉高脂饲料组黄鳝血清甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、血氨experimental autoimmune myocarditis、尿素氮、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、酸性磷酸酶与免疫球蛋白M含量显著增加(P<0.05),且碱性磷酸酶活性显著降低(P<0.05),而添加2%大豆卵磷脂使黄鳝血清的高密度脂蛋白含量与碱性磷酸酶活性显著增加(P<0.05),低密度脂蛋白、血氨、尿素氮、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、酸性磷酸酶与免疫球蛋白M水平显著下降(P<0.05);(3)与对照组相比,低鱼粉高脂组黄鳝后肠绒毛高度与杯状细胞显著降低(P<0.05),而添加2%大豆卵磷脂后黄鳝后肠绒毛高度与杯状细胞数目上升;(4)与对照组相比,低鱼粉高脂组不动杆菌属与考克氏菌属相对丰度上升,而与低鱼粉高脂组相比,添加2%大更多豆磷脂后黄鳝肠道群落的丰富度与多样性显著增加(P<0.05),且显著提高了肠道红杆菌属的相对丰度,并显著减少不动杆菌属与考克氏菌属的丰度(P<0.05)。由此得出,在试验条件下, 2%大豆卵磷脂可促进脂肪代谢和提高机体免疫性能,并修复肠道组织结构与维持菌群稳态,进而缓解低鱼粉高脂饲料对黄鳝生长的负面影响。

目的环境中抗生素残留物可严重影响功能微生物群落。厌氧环境中的微生物群落在氮和碳循环中发挥着重要作用。微生物群落借助群体感应表现出复杂环境适应性。本实验中,我们研究了AHLs在厌氧环境中调节微生物氮和碳循环对抗生素的反应,并推测AHLs的关键调节途径,为修复环境提供新思路。材料方法本实验采用实验室独立设计小型厌氧发酵罐。模型设置空白对照组(CK组)、土霉素(OTC)组(OT组OTC 10.0 mg/L)和AHLs附加组(HO组OTC 10.0 mg/L+AHLs:500 nmol/L)。将产生气体收集并量化,测量发酵产物理化指标。高效液相色谱串联质谱法检测AHLs含量。通过宏基因组分析功能基因结构差异特征,探究差异变化中的重要枢纽基因,推测AHLs调节的关键调控通路,注释样品中重组菌株基因组,为关键调控通路的预测提供证据。结果整个厌氧发酵过程中,CK组的累积产气量低于其他两组。在第20天,HO组总碳消耗比例高于OT组。加药前样品中,AHLs在三组检测到了相近的微量浓度。OT组C8-HSL、C10-HSL对土霉素添加产生响应。样品中,反硝化更容易受到OTC/AHL的影响。硝酸还原酶,硝酸盐/亚硝酸盐还原酶对OTC/AHLs敏感。甲烷代Entinostat谢通路对抗生素和AHLs比较敏感,甲基辅酶M还原酶是OTC/AHLs的主要响应者。构建结构方程可知,OTC/AHLs是氮/甲烷代谢基因结构的主要影响因素VX-661。模型中共同枢纽基因注释到生物膜形Religious bioethics成相关系统,其中起到决策作用的多个通路可被AHLs所调控。从样品中获取的重组基因组同时注释到群体感应、生物膜形成和碳氮代谢。结论本论文一定程度证实了AHLs对厌氧微生物抗生素响应可能具备的调控作用,AHLs减弱了抗生素对部分功能菌群的抑制作用。在刚受到抗生素污染的环境中微生物群落可能借助AHLs类群体感应缓解抗生素产生的影响。厌氧条件下AHLs可能通过调控谷氨酸代谢酶或硝态氮/亚硝态氮转运蛋白来影响抗生素胁迫下功能菌群的改变。借助AHLs调控微生物氮循环能够进一步优化利用畜禽养殖业高抗粪污厌氧发酵产能。生物膜形成、甲基化趋化蛋白和鞭毛合成可能是AHLs调控作用的主要影响通路,这些通路都与生物膜的定植和增殖过程相关。可进一步借助AHLs调控机制为利用生物絮膜污水系统处理高抗污水提供指导。

传统癌症治疗方法存在较大的内在局限性,比如创伤性较大,非特异性等,而这一现状促使多项纳米药物的开发和应用。纳米药物的发展日益壮大的主要原因是纳米平台在药物输送、诊断、成像、合成疫苗开发和微型医疗设备等领域具有很独特的吸引力,以及部分纳米材料本身具有治疗作用。纳米平台为化疗,光热治疗,铁死亡等治疗肿瘤手段的实现提供了新的平台,因此纳米药物成为肿瘤治疗和研究热点中的新的生物医学突破。鉴于当前现状,我们致力于研究铁死亡协同其他治疗手段的纳米药物的开发,比如协同光热治疗,免疫治疗,以实现肿瘤的有效治疗。鉴于此,本论文构建了三个通过铁死亡治疗肿瘤的纳米平台,并在体外和体内研究了这三个纳米平台在肿瘤治疗中的应用。具体研究内容如下:第一部分:MPDA@Fe_3O_4-Era纳米平台的制备及其用于磁共振成像指导的抗肿瘤的研究。首先,通过盐酸多巴胺在碱性条件下自聚合形成介孔聚多巴胺(MPDA),然后通过π-π堆叠和疏水作用力装载上了阿拉斯汀(Era)和四氧化三铁(Fe_3O_4),成功制备了诊疗一体化的MPDA@Fe_3O_4-Era纳米平台。通过投射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)可以看出纳米颗粒呈球形,直径约76nm,通过激光粒度仪(DLS)分析测得纳米颗粒的水合粒径为196 nm。此外,通过检测纳米材料在水中14天内的粒径及PDI变化,发现其具有较好的稳定性和分散性。通过检测不同p H和NIR刺激下药物的释放,测得MPDA@Fe_3O_4-Era呈现缓释药物的特点。通过测定纳米材料在不同浓度和激光强度条件下的升温曲线,测得了其光热转换效率为40.3%。同时,该纳米材料具有较好的T2加权成像能力。另外,在细胞毒性方面,证明MPDA具有很好的生物相容性,并且MPDA@Fe_3O_4-Era具有时间依赖的细胞内化能力,浓度依赖和激光强度依赖的细胞毒性,MPDA@Fe_3O_4-Era联合PTT能产生大量的ROS和LPO,损伤线粒体功能发生,下调ATP生成。在机制通路方面,发现MPDA@Fe_3O_4-Era能通过抑制system X_C~-信号通路和促进铁代谢来抑制GSH,提高MDA和铁离子水平,促进铁死亡。接下来,发现了MPDA@Fe_3O_4-Era可以通过铁死亡产生LPO,进一步交联抑制HSP70,从而放大PTT的疗效。然后,通过体内分布实验,发现在小鼠肿瘤组织有带有荧光的MPDA@Fe_3O_4-Era的蓄积,并在12 h后达到最大值。通过光热成像实验,发现在小鼠肿瘤部位在NIR(808 nm)下升温至43℃。最后设计了体内抗肿瘤治疗模型,发现MPDA@Fe_3O_4-Era联合PTT的肿瘤体积最小。治疗周期结束后,MPDA@Fe_3O_4-Era给药组的生化指标,血常规,心肝脾肺肾的染色与对照组相比,没有显著性差异,均在正常范围。体内外抗肿瘤实验均表明MPDA@Fe_3O_4-Era具有较强的抗肿瘤效应,并且其安全性良好。第二部分:MP-FA@R-F纳米平台的制备及其用于协同光热治疗的抗肿瘤免疫治疗。首先,通过盐酸多巴胺在碱性条件下自聚合形成MPDA,然后通过π-π堆叠在其表面加载了Fe_3O_4和大黄酸(rhein),最后在表面修饰上FA,成功制备了MP-FA@R-F纳米平台。通过检测不同p H和NIR刺激下药物的释放量,测得MP-FA@R-F具有缓释药物的特点;并且通过TEM观察在不同p H条件下孵育,纳米材料由完整球形逐渐崩解为模糊碎片。通过测定纳米材料在不同浓度和激光强度条件下的升温曲线,测得了其光热转换效率为37.7%。同时,该纳米材料具有较好的T2加权成像能力。另外,在细胞毒性方面,证明了MP-FA@R-F具有时间依赖和激光强度依赖的细胞毒性,同时MP-FA@R-F具有时间依赖的细胞内化能力,MP-FA@R-F联合PTT能升高ROS水平,破坏线粒体和溶酶体功能。通确认细节过评估GSH水平,胞内铁离子浓度和相关蛋白表达,发现MP-FA@R-F通过铁死亡和凋亡双条途径来抑制GSH水平,和提高铁离子浓度诱导细胞死亡。然后,通过体内MR实验,发现MP-FA@R-F可以有www.selleck.cn/products/Nolvadex效蓄积在小鼠肿瘤部位,并在12 h后达到峰值。接下来,通过光热成像实验,发现了在荷瘤小鼠的肿瘤部位在NIR(808 nm)下,温度升高至43℃。然后通过抗肿瘤治疗模型,发现MP-FA@R-F联合PTT的肿瘤抑制现象最明显。然后通过体内免疫应答实验,证明MP-FA@R-F联合PTT可以诱导DC细胞成熟,并提高CD8+、CD4+T细胞在肿瘤部位的浸润程度。最后分析生化指标(ALT,ALB,BUN)和主要器官(心肝脾肺肾)H&E染色和小鼠体重变化,证明了MP-FA@R-F纳米材料具有良好的生物安全性。第三部分:LP-Ca P@i BEFT纳米平台的制备及其协同免疫治疗的抗肿瘤研究。首先,通过在水溶性环境生物矿化erastin,brequinar,i FSP1和Fe~(3+),并在纳米材料外面修饰Lf,成功制备了生物矿化的LP-Ca P@i BEFT纳米平台。通过检测不同p H刺激下药物的释放量,测得LP-glioblastoma biomarkersCa P@i BEFT能缓慢释放药物;并且通过TEM观测在不同p H条件下孵育,纳米材料由完整核壳结构逐渐崩解为模糊碎片。另外,在细胞毒性方面,证明了LP-Ca P@i BEFT对4T1的细胞毒性,而对正常细胞HUVEC则没有影响;同时4T1细胞对LP-Ca P@i BEFT的吞噬具有时间依赖的特点,LP-Ca P@i BEFT组的细胞毒性最强,能升高ROS和LPO水平,破坏线粒体和溶酶体功能。我们分别评估GSH,MDA水平,胞内铁离子浓度和铁死亡相关蛋白表达,发现LP-Ca P@i BEFT能促进细胞铁死亡。接下来,通过共聚焦显微镜发现LP-Ca P@i BEFT能显著上调HMGB1和CRT的水平。通过流式分析发现,LP-Ca P@i BEFT能促进DC细胞成熟。然后,通过体内荧光分布实验,发现LP-Ca P@i BEFT能蓄积在荷瘤小鼠的肿瘤部位,并在12 h后达到峰值。接下来,设计了体内抗肿瘤治疗模型,发现LP-Ca P@i BEFT+anti PD-L1组的肿瘤抑制最明显。通过流式分析肿瘤单细胞悬液,发现LP-Ca P@i BEFT+anti PD-L1组能诱导DC细胞成熟,并促进CD4+、CD8+T细胞在肿瘤部位的浸润。最后,在治疗周期结束后,分析生化指标(ALT,ALB,BUN)和主要器官(心肝脾肺肾)H&E染色和小鼠体重变化,证明了LP-Ca P@i BEFT纳米材料具有良好的生物安全性。

尽管现代医疗技术不断发展,但癌症仍对全世界人类的健康构成严重威胁。癌症很难或不可能治愈,因为它涉及各种遗传变化和细胞异常;www.selleck.cn/products/Etopophos此外,其复杂性和异质性促进了癌细胞的侵袭性生长,导致显著的发病率和死亡率。肿瘤治疗的三种传统方法包括手术、放疗和化疗,然而由于严重的手术创伤、非特异性和过度的辐射,以及这些疗法在靶向性、生物相容性、多重耐药性和药物积累方面具有不可替代的缺陷,患者可能会出现严重的生理副作用,导致生活质量差,难以达到目标治疗效果。这些治疗缺陷激发了新的、精确的、更有效的肿瘤治疗策略的发展。例如,几种新兴的治疗方法,如光动力疗法(PDT)、光热疗法(PTT)和光声疗法已经改善或可能改善治疗结果。PTT过程中产生的热量除了直接消融肿瘤外,还可以实现其他治疗化合物的按需释放,调控基因转录和酶活性,增强肿瘤组织的化学反应,从而实现光热协同抗癌,可以克服单模式治疗的障碍,往往会产生超级加性效应,称为“1+1>2”,这种多模式治疗疗效显著,因此可以通过物理吸附或化学结合将不同类型的治疗剂组合在单个纳米结构中来构建多功能纳米材料,用于创建肿瘤的多模态协作治疗。共价有机骨架(COFs)是21世纪初发现的一类有机结晶多孔材料,由于其高结晶度、固有孔隙率、结构规整性、多种功能、设计灵活性和出色的稳定性,已成为一类极具吸引力的新兴材料。研究发现,COFs具有很好的生物相容性和可忽略的全身毒性,因此是癌症治疗中一种很有前途的纳米药物递送平台。基于癌症治疗的现状,考虑了COFs在生物医学方面的优势,本文从以下方面开展了研究工作。在本文的第一章中,介绍了基于不同键的COFs类型以及COFs作为纳米递送系统在生物医学方面的应用和挑战,并总结了目前广泛应用的光热纳米材料的优劣。在本文的第二章中,设计合成了GOx@COF-ICG纳米材料,这是一种基于COF的纳米反应器,将吲哚菁绿(ICG)与COF进行共价连接成功解决了ICG的光漂白问题。COF-ICG具有很高的光热转换率,且负载了葡萄糖氧化酶(GOx)后,能够通过降低体内腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)和热休克蛋白(HSPs)的含量抑制体内光热消KPT-330体内融防御机制,同时与饥饿疗法协同作用,增强光热消融,达到更好的治疗效果。在本文的第三章中,设计合成了COF@Ca O_2-HA纳米材料,首先通过溶剂热法成功得到了一种本身具有光热性能的纳米COF,随后在COF上原位生成了过氧化钙(Ca O_2)和透明质酸(HA)。HA具有很好的生物靶向性,而Ca O_2在肿瘤酸性微环境中能够与肿瘤间质液中的水反应,导致具有细胞毒性的过氧化氢(H_2O_2)和钙离子的积累,并缓解肿瘤内缺氧环境,同时肿瘤外间质液的消耗有利于纳米材料对肿瘤部位bloodstream infection的渗透,有利于材料更好的发挥光热作用。COFs作为近年来备受瞩目的有机纳米材料,本身具有不可替代的优势,但COFs在生物医学上的应用探索任重而道远,科研人员还在不断开发性能更加优异的COFs,努力将COFs的优势发挥在生物医学领域。

前言肺癌现为全球肿瘤发病率里排行第二,死亡率排行第一的疾病。虽然肺癌的治疗方法和手段已取得了很大进步,但是其复发率与死亡率仍然居高不下。肺癌的研究因缺乏一个有效的体外模型而导致研究进展有限。如今,2D细胞系模型和人源异种移植动物模型(Patient-derived xenografts,PDX)已成为肺癌研究模型的金标准。2D细胞系模型因其低成本、简单快速的特点在实验研究中广泛应用。但是2D细胞系模型仅仅只能代表肿瘤其中的一种亚群,并且在长期的体外2D平面生长增殖过程中,肿瘤细胞缺少体内生长的环境,导致很难保持体内原始肿瘤的一些生物学功能。PDX动物模型相比于2D细胞系模型更加接近人体真实的肿瘤生长微环境,保证细胞的基因表达和表型。但是人源异种移植动物模型的费用高昂且时间成本效率低下,导致其应用也受到限制。鉴于上述,本研究拟通过3D生物打印技术,探讨构建一个3D肺癌体外模型,除肿瘤细胞外,同时关注肿瘤细胞的生长微环境。使构建的3D肺癌体外模型更加适用于抗肿瘤药物的研发和筛选,为肿瘤患者的个性化治疗提供一个更优秀的验证平台。第一部分基于3D生物打印技术和RNA测序技术的肺癌体外模型研究目的:通过3D生物打印技术构建一个肺癌的体外模型,评估肺癌体外模型的可行性。通过转录组测序来对比2D及3D的肺癌细胞的差异基因及功能富集。方法:1.使用非小细胞肺癌细胞系的A549细胞与海藻酸钠/明胶/纤维蛋白原混合,当作3D打印的生物墨构建肺癌体外模型的水凝胶支架,使用氯化钙(Ca Cl_2)/谷氨酰胺转胺酶(TGase)/凝血酶作为交联剂。其中Ca Cl_2用于交联海藻酸钠,谷氨酰胺转胺酶用于交联明胶,凝血酶用于交联纤维蛋白原。2.使用迈普医学生产的多喷头3D生物打印机(Liv Print~(TM))进行本实验的3D打印生物打印。将3D生物打印机装载含有A549细胞的海藻酸钠/明胶/纤维蛋白原生物墨水,通过电脑设定预定的打印路线,利用挤出式打印机打印出一个50×50mm的纵横交错的网格状水凝胶支架。支架打印在预冷的平台上,3D生物打印机打出的温敏材料在接触的温度低的平台会进行一个简单的成型,此时的水凝胶支架尚不牢固,随后通过Ca Cl_2/TGase/凝血酶交联水凝胶支架后,使其形成一个稳定的可供A549细胞生长的genetic population3D空间多级孔的肿瘤模型。3.对打印并交联完成后的体外肿瘤模型进行后续研究,使用显微镜及电子显微镜对3D体外肺癌肿瘤模型进行观察。对肺癌体外肿瘤模型进行生物学评价,使用活/死试剂检测打印后模型内A549细胞的活死率。使用阿尔玛兰(Alamar Blue)测定肺癌体外肿瘤模型增值能力测定。4.收集2D及3D体外肿瘤模型培养的A549细胞,通过转入组测序对其进行生物信息学分析。结果:1.通过3D生物打印技术,使用海藻酸钠/明胶/纤维蛋白原体系作为生物墨水,打印出的体外肺癌肿瘤模型为适宜A549细胞生存的多孔级结构模型。通过光学显微镜、电子显微镜及HE染色等实验观察发现,3D模型比2D细胞系模型相比更加接近人体真实的生长环境。2.生长第15天时,2D组内A549细胞的存活率为91.10%±1.3%,3D肺癌体外模型内的A549细胞存活率为89.76±2.3%,2D与3D组在细胞存活率方面无明显差别,P>0.05,无统计学差异。3.在细胞增殖率测定中,发现在2D组的细胞在前5天生长速率极快,而在5天之后,增长速率放缓;细胞培养至第9天以后,细胞增殖出现一个下降的过程。而在3D组细胞在一开始一直处于缓慢的生长过程,在第12天时增长率处于一个顶峰,随后增长率出现一个下降的趋势。Alamar Blue测定2D组与3D组第15天的相对增殖率,与第1天细胞相比,培养至第18天时3D组细胞增长了1.82倍,2D组细胞增长了1.31倍,P<0.确认细节05,具有统计学差异4.通过转录组测序对比2D和3D体外肺癌模型的A549细胞,以p值≤0.05,|Log2Ratio|≥1为筛选条件,具有差异表达基因共3112个,其中上调基因1189个,下调基因1923个。对差异基因进行功能富集分析后,这些差异基因影响了A549细胞的生物学的调控,从而促进了肺癌的进展。结论:本部分的研究通过使用3D生物打印技术,构建出可以持续性生长的肺癌体外肿瘤模型。通过观察,该体外模型与2D模型相比,更加接近真实的人体肿瘤生长环境。3D肺癌体外模型中A549的存活率与2D组无明显差别。肺BLZ945价格癌体外模型内A549的增殖率并未因生长环境的改变而下降明显。转录组测序结果显示2D与3D肺癌模型中,两种环境下培养的A549细胞基因表达量存在差异,并且具有各自特征的基因表达谱。通过富集分析发现差异基因与细胞周期、NF-KAPPA-B、PI3K-AKT等信号通路相关。证明3D的生长环境促进了肺癌细胞的发展。3D生物打印为研究肺癌肿瘤微环境的机制及抗癌的药物筛查可能提供一个新的研究平台。第二部分同轴3D生物打印构建肺癌体外模型目的:使用同轴3D生物打印技术构建壳/芯肺癌体外模型,评估该模型培养A549细胞的可行性,同时对比2D模型与同轴打印的3D模型中A549细胞的生物功能及耐药性差异,为后续细胞-细胞之间相互作用研究提供基础。方法:1.使用3D生物打印机构建壳/芯水凝胶构建肺癌体外模型,采用特制同轴打印针头可打印出两条单独的通道,芯通道中包含肿瘤细胞悬液/Ca2+,壳通道采用的材料是海藻酸钠/明胶。在打印初期,两条通道水凝胶接触在一起之后,在芯通道中Ca2+与壳通道中的海藻酸钠立即交联,在两条通道之间形成一道交联壁,芯内细胞可在内轴中自由通行。打印结束后,使用Ca Cl2将水凝胶整体交联,使得整个体外肺癌模型变得稳定牢固,完成壳/芯A549水凝胶支架。2.使用光学显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、HE染色观察该肺癌体模型,使用活/死试剂检测打印后细胞整体存活率,使用Alamar Blue检测打印之后整体的增值能力及化疗药物顺铂处理后的耐药性测定。使用细胞划痕实验,Transwell实验检测肺癌体外模型的侵袭与迁移能力。结果:1.同轴3D生物打印可以构建壳/芯肺癌体外模型。在该模型中细胞可以在芯内通道的3D环境中进行自由的生长,同时在外壳中形成多孔级网状结构,与外界培养基可以交换营养物质及释放代谢物。2.同轴3D组与2D组中A549细胞通过活/死检测,发现在培养第10天时3D组细胞的存活率在86.6±2.3%,2D组细胞的存活率为91.77±3.2%,2组细胞存活率无明显差异,P>0.05,无统计学差异。3.同轴打印的体外模型后第1天,细胞在水凝胶内轴呈单个的散在存在。第3天,细胞出现自主装成团聚集。而培养到第10天时,壳-芯水凝胶支架仍然完好无损,细胞填满整个内轴。Alamar Blue测定2D组与3D组第7天的相对增殖率,与第1天细胞相比,培养至第7天时3D组细胞增长了2.34倍,2D组细胞增长了2.13倍,P<0.05,具有统计学差异。4.同轴3D打印肺癌模型中A549细胞更加耐受药物处理。经过32ug/ml的DDP处理48h之后,2D组的细胞相对存活率为7.92±3.2%,3D组的细胞相对存活率为19.54±2.7%,P<0.05,具有统计学差异。5.同轴3D组与2D组细胞在在划痕实验中,3D组的相对迁移距离为0.374,2D组的相对迁移距离为0.217,P<0.05,具有统计学差异;在Transwell迁移实验中,3D组迁移的细胞数量为1104个,2D组为524个,P<0.05,具有统计学差异;在Transwell侵袭实验中,3D组穿透小室的细胞数量为942个,2D组为349个,P<0.05,具有统计学差异。结论:本部分研究通过同轴3D生物打印出壳/芯水凝胶支架是一种优秀且稳定的体外肺癌肿瘤模型,在该模型下培养的A549细胞的存活率及增殖能力良好。与2D组相比,同轴打印的壳/芯A549水凝胶支架中A549细胞的活性及增殖无明显的差异。同轴3D组与2D组相比,A549细胞具有更强在侵袭及迁移能力,并且具有更强的耐药性。同时同轴3D生物打印出的肺癌体外模型可能作为新的筛药平台使用。第三部分同轴3D生物打印研究肺癌细胞与间充质干细胞之间的相互作用目的:本部分的研究使用同轴3D生物打印技术,构建一个壳MSC/芯A549的肺癌体外模型,模拟体内肺癌肿瘤微环境,研究3D肺癌体外模型中A549细胞致瘤性,以及了解肺癌体外模型中A549与MSC之间的相互作用的机制。方法:1.使用明胶/海藻酸钠为原料,使用同轴3D生物打印技术构建壳MSC/芯A549水凝胶支架。2.通过qPCR对2D-A549、壳/芯A549和壳MSC/芯A549模型中的A549细胞进行检测,检测其与A549细胞干性有关的CD44,CD133,SOX2和NANOG相对表达量,与EMT相关的N-Cadherin,E-Cadherin,fibronectin,Twist1和Snail1相对表达量,与细胞侵袭有关的MMP2和MMP9相对表达量。3.制备2D-A549和3D-MSC共培养的条件培养基(Conditioned medium,CM1)和A549/MSC的条件培养基(CM2)分别培养肺癌体外肿瘤模型,收集A549细胞,使用qPCR对其进行致瘤性评价。4.使用qPCR检测2D-MSC、3D-MSC和壳MSC/芯A549中MSC细胞的IL-10、TGF-β1和CXCL12经典的肿瘤增强子的表达水平。5.通过裸鼠异移植瘤模型验证肺癌体外模型中A549细胞致瘤能力。结果:1.同轴打印可以构建壳MSC/芯A549体外肺癌肿瘤模型,通过此模型可以作为研究细胞与细胞之间相互作用的新的平台。2.qPCR检测同轴打印的壳MSC/芯A549模型中A549的细胞干性。结果显示,与第5天的2D-A549组相比,第15天的壳/芯A549模型中A549细胞的CD44、CD133、SOX2、NANOG相对表达分别为4.8、3.8、3.1、14.7倍。第15天的壳MSC/芯A549模型中A549细胞的CD44、CD133、SOX2、NANOG相对表达分别为5.1、5.3、3.4、18.7倍;以上所有P<0.05,具有统计学差异。3.qPCR检测同轴打印的壳MSC/芯A549模型中A549的EMT标志物。结果显示,与第5天的2D-A549组相比,第15天的壳/芯A549模型中A549细胞的N-cadherin、E-cadherin、Fibronectin相对表达分别为4.8倍、0.23倍、5.5倍,P<0.05,具有统计学差异;Snail1和Twist1的相对表达无明显变化。第15天的壳MSC/芯A549模型中A549细胞的N-cadherin、E-cadherin、Fibronectin、Snail1和Twist1的相对表达分别为5.1倍、0.20倍、6.2倍、4.9倍和5.8倍,P<0.05,具有统计学差异。4.qPCR检测同轴打印的壳MSC/芯A549模型中A549细胞的迁移能力标志物。结果显示,与第5天的2D-A549组相比,第15天的壳/芯A549的MMP2、MMP9的相对表达分别为3.1、2.7倍。第15天的壳MSC/芯A549的MMP2、MMP9的相对表达分别为5.7、5.8倍。以上所有P<0.05,具有统计学差异。5.使用条件培养基处理壳/芯A549细胞之后,发现壳/芯A549细胞的致瘤能力有所增强。与2D-A549相比,未用条件培养基处理的MSC/芯A549的MMP9、CD133、NANOG的相对表达量分别为10.2、3.21、4.45倍,CM1处理之后相对表达分别为13.3、3.9、10.8倍;CM2处理之后相对表达分别为13.6、4.5、11.6倍。以上所有P<0.05,具有统计学差异。6.qPCR检测3D模型中的MSC的经典肿瘤增强因子IL-10、TGF-β1和CXCL12的表达,结果显示,2D-MSC相比,3D-MSC中IL-10、TGF-β1和CXCL12的相对表达分别为7.5、3.3、3.5倍;壳MSC/芯A549中的MSC细胞IL-10、TGF-β1和CXCL12的相对表达分别为7.96、3、4.3倍。以上所有P<0.05,具有统计学差异。7.壳MSC/芯A549、壳/芯A549模型中的A549细胞与2D相比,致瘤能力更强。在第24天,2D组移植瘤体积为255.3mm3,壳/芯-A549组移植瘤体积为585.4 mm3,壳MSC/芯A549组移植瘤体积为661.071 mm3。P<0.05,具有统计学差异。结论:通过同轴3D生物打印的体外肺癌模型作为研究平台,证实肺癌细胞与MSC细胞相互作用之后的具有更强的致瘤性。A549与MSC相互作用下产生肿瘤增强剂分泌在培养基中,从而增强肺癌的致瘤能力。裸鼠移植瘤模型也验证了共培养之后的A549细胞更加具有致瘤性。结论1.本研究通过3D生物打印技术构建肺癌体外模型,探索并确认3D生物打印构建肺癌体外模型的可行性,同时使用转录组测序技术对比2D与3D组细胞之间的基因表达量的差异,将差异基因进行功能富集发现3D环境能促进肺癌的进展。2.通过同轴3D生物打印技术构建壳/芯A549模型,与2D组细胞相比,壳/芯A549模型中的A549细胞具有更强的侵袭与迁移能力。同时可作为细胞-细胞之间相互作用的新型研究平台。3.通过同轴打印技术构建细胞-细胞相互作用的壳MSC/芯A549体外模型,证实A549与MSC发生相互作用之后具有更强的致瘤能力。同轴打印的壳/芯水凝胶模型不仅可以模拟3D肺癌微环境,同时也可以为研究细胞-细胞之间的相互作用机制提供平台。