发酵过程中腐乳鲜味物质快速定量检测方法及其品质分析

腐乳作为我国传统发酵食品的重要组成部分,因其风味独特、滋味鲜美、营养价值高等优点而深受广大消费者的喜爱。天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、5′-肌苷酸(5′-IMP)、5′-鸟苷酸(5′-GMP)是腐乳呈鲜味的重要氨基酸和核苷酸,对腐乳的滋味品质有重要影响。常见鲜味物质的检测方法存在样品前处理复杂、仪器检测条件苛刻、价格昂贵、检测时间长等缺点。因此,寻找快速定量检测发酵食品鲜味物质的方法变得尤为重要。此外,消费者对腐乳的接受度依赖于外在和内在因素,外在因素有价格和品牌信誉等,内在因素如营养、口味、外观等,则与腐乳的物理化学等特性有关。食品的物理化学特性常受到外界因素的影响,如生产工艺、生产和贮藏环境条件等。发酵是腐乳生产过程中的重要环节之一,伴随着多种复杂的物理化学反应,为了更好地对腐乳品质进行分析和控制,需要系统而全面地了解腐乳发酵过程中的成分变化及其相互作用关Immune trypanolysis系。因此,本研究基于电化学机理以及鲜味物质结构分析,分别制备能够对鲜味氨基酸和核苷酸进行快速定量检测的电化学传感器装置,并将其应用于实际腐乳样品鲜味物质的检测中。同时,对发酵过程中腐乳的理化品质变化特征及其相关性进行研究,以期为腐乳品质分析及改善提供理论依据和支撑。本文的主要研究内容和结果如下:(1)针对发酵过程中腐乳鲜味氨基酸检测的N,N’-二苯基硫脲(DPTU)膜修饰传感器的应用研究。采用氨基酸分析仪对腐乳发酵过程中的氨基酸进行检测,结果共检测到16种游离氨基酸(FAAs),其中鲜味氨基酸占FAAs总量的40.51%。基于DVX-661 MWPTU类似路易斯碱结构和能够吸收电子云或者相应的原子团的特性,采用DPTU膜修饰传感器,探究开路电位值与标准品鲜味Glu和Asp浓度之和的数学关系,并将其应用于实际样品腐乳发酵过程中鲜味氨基酸的检测。试验结果表明该传感器可以对腐乳中的鲜味Glu和Asp浓度之和进行定量检测。(2)针对5′-IMP检测的聚甲硫氨酸(P Met)膜修饰传感器的研究及应用。采用电化学聚合的方法,利用氨基酸化合物之间的特异性吸附,制备针对5′-IMP检测的P Met膜修饰传感器。通过物理和电化学表征,试验结果表明P Met膜修饰传感器可以实现对5′-IMP的特异性吸附。采用差分脉冲伏安法(DPV)和循环伏安法(CV)对P Met膜修饰传感器检测5′-IMP的条件参数进行优化,并对不同浓度的5′-IMP标准品进行检测,结果表明,P Met膜修饰传感器对5′-IMP响应的氧化峰电流值与其浓度呈现良好的线性关系,具体为:在1~15μmol/L的5′-IMP浓度范围内,线性方程为I_1=0.1036(±0.0049)C_1+2.8035(±0.0235),相关系NSC 127716使用方法数为0.9926;在15~500μmol/L的5′-IMP浓度范围内,线性方程为I_2=0.0023(±0.0001)C_2+4.3135(±0.0267),相关系数为0.9938。检测下限为0.3367μmol/L(S/N=3)。试验结果表明,P Met膜修饰传感器在抗干扰性、重现性和稳定性方面性能良好,可用在腐乳样品5′-IMP的特异性检测中。(3)针对5′-GMP检测的分子印迹传感器的研究及应用。以5′-GMP为模板分子,邻苯二胺(OPD)为单体,通过电化学聚合OPD和沉积纳米银(Ag NPs)的方法在羧基化多壁碳纳米管(SMWCNTs)修饰的玻碳电极(GCE)上构建针对5′-GMP检测的分子印迹传感器(Ag NPs/SMWCNTs/MIP/GCE)。通过物理和电化学表征,试验结果表明该分子印迹传感器可以实现对5′-GMP的特异性检测。采用DPV法对该传感器检测条件参数进行优化,并对不同浓度的5′-GMP标准品进行检测,结果表明,该分子印迹传感器对5′-GMP响应的氧化峰电流值与其浓度对数呈现良好的线性关系,具体为:线性方程为I_3=0.5557(±0.0197)lg C_3+8.3996(±0.1995),检测范围为0.05~50.00 mmol/L,相关系数为0.9938,检测下限为0.009 mmol/L(S/N=3)。试验结果表明,该分子印迹传感器在抗干扰性、重现性和稳定性方面性能良好,可用在腐乳样品5′-GMP的特异性检测中。此外,该传感器将分子印迹与电化学传感器相结合,不仅实现了传感器对5′-GMP的特异性检测,同时还使用快速简便的电化学聚合单体方法,增加了模板分子的结合位点,从而间接提高了传感器的检测效率。(4)发酵过程中腐乳理化成分变化特征及其相关性分析。对发酵过程中腐乳的多项理化指标如营养指标(粗蛋白、粗脂肪、还原糖、氨基酸态氮、总酸、盐分和水分)、鲜味指标(Glu、Asp、5′-IMP和5′-GMP)、质构指标(硬度、粘性、弹性、内聚性、胶着性和咀嚼性)、颜色指标(明度、红度和黄度)和其他指标(电导率、浊度和p H值)等进行了动态的测定及分析,揭示了腐乳在发酵过程中的成分变化规律及原因,并对腐乳发酵过程中不同发酵阶段腐乳坯的营养组分与鲜味、质构、颜色、电化学等特征进行了相关性研究,具体为Glu与总酸呈显著正相关(P<0.05);Asp与总酸、还原糖呈极显著正相关(P<0.01),与粗蛋白、粗脂肪呈极显著负相关(P<0.01);5'-IMP与食盐呈极显著正相关(P<0.01);5'-GMP与食盐呈极显著正相关(P<0.01)。硬度、粘性、弹性、内聚性、胶着性、咀嚼性与粗蛋白和粗脂肪呈极显著正相关(P<0.01),与氨基酸态氮和总酸呈极显著负相关(P<0.01),与还原糖呈负相关。L*与粗蛋白、粗脂肪呈极显著正相关(P<0.01),与氨基酸态氮、总酸呈极显著负相关(P<0.01);a*与水分呈显著负相关(P<0.05),;b*与氨基酸态氮、总酸呈极显著正相关(P<0.01),与粗蛋白、粗脂肪呈极显著负相关(P<0.01)。浊度与水分呈显著负相关(P<0.05);电导率与食盐、氨基酸态氮、总酸呈正相关,与粗蛋白、粗脂肪、水分呈负相关;p H值与食盐呈正相关。

烟曲霉、白念珠菌诱导巨噬细胞自噬流、焦亡的初步研究

研究背景侵袭性真菌感染主要包括侵袭性念珠菌病、侵袭性烟曲霉病等,在免疫缺陷患者中具有高发病率和死亡率,严重危害患者的生命安全。其中,白念珠菌和烟曲霉是侵袭性真菌感染中非常重要的两种真菌病原体。宿主巨噬细胞在抗真菌感染中发挥重要作用,对巨噬细胞的抗真菌免疫机制研究非常重要。自噬是一种保守的细胞应激反应,在抗感染免疫反应中发挥重要作用。真菌感染可以诱导巨噬细胞自噬,有助于胞内真菌清除,从而消除感染。自噬过程包括吞噬泡形成、自噬体形成、自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体、自噬溶酶体降解等4个步骤;自噬流是这些步骤在细胞内连续出现的动态过程,常用来评价细胞自噬是否行使正常功能。目前有研究证实烟曲霉可诱导巨噬细胞自噬,但是关于烟曲霉early antibiotics对巨噬细胞基础自噬流的影响尚无定论。焦亡是一种比较新的程序性死亡方式,近些年来焦亡已成为感染领域的研究热点。既往关于细胞焦亡的研究主要是关注细菌和病毒感染,但越来越多的证据表明,焦亡在真菌感染中也发挥着关键作用。目前尚关于无烟曲霉及白念珠菌诱导巨噬细胞焦亡的直接证据,关于烟曲霉及白念珠菌能否直接诱导巨噬细胞焦亡以及焦亡发生的生物学意义仍不明确。研究目的本研究的主要目的是,探索烟曲霉对小鼠巨噬细胞自噬流的影响;通过体外及体内实验对烟曲霉能否诱导巨噬细胞焦亡进行初步研究,并初步探索巨噬细胞焦亡在烟曲霉系统感染中发挥的作用以及焦亡的发生机制;通过体外实验对白念珠菌诱导小鼠巨噬细胞焦亡进行初步研究。研究方法1.烟曲霉体外刺激小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)不同时间,免疫印迹法(WB)检测自噬关键蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)-Ⅰ型/Ⅱ型的转换及磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)Ser2481的蛋白水平;烟曲霉和溶酶体阻断剂单独或联合体外刺激BMDMs不同时间后,WB检测LC3-Ⅱ蛋白水平。2.烟曲霉体外刺激BMDMs后,活细胞工作站观察细胞焦亡样形态;实时荧光定量PCR(qRTPCR)检测NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白(NLRP3)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)mRNA表达水平;WB检测NLRP3、胱天蛋白酶-1(caspase-1)、Gasdermin D(GSDMD)的表达水平;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-1β、IL-18分泌水平;敲除GSDMD后,检测焦亡指标的变化。3.构建烟曲霉系统感染模型,比较WT小鼠及GSDMD KO小鼠的生存时长、体重变化、脏器菌载量,WB检测WT小鼠各脏器的GSDMD表达水平,WB检测WT小鼠及GSDImidazole ketone erastin纯度MD KO小鼠脾脏巨噬细胞的NLRP3、caspase-1、GSDMD表达水平,ELISA检测WT小鼠血液及脾脏匀浆的IL-1β、IL-18水平。4.分别抑制THP-1巨噬样细胞的NLRP3、caspase-1、树突细胞相关性C型凝集素 1(Dectin-1)、膜结合 Toll 样受体(TLR)2、TLR4、核转录因子 kappaB(NF-κB)、胞外信号调节激酶(ERK 1/2),再行烟曲霉体外刺激THP-1巨噬样细胞,通过WB检测GSDMD表达水平。5.白念珠菌体外刺激BMDMs后,活细胞工作站观察细胞焦亡样形态,qRT PCR检测 NLRP3、IL-1β、IL-18 mRNA 表达水平,WB 检测 NLRP3、caspase-1、GSDMD的表达水平,ELISA检测IL-1β、IL-18分泌水平,流式细胞术比较WT及GSDMD KO BMDMs对白念珠菌的吞噬率,流式细胞术及LDH释放法分别比较WT及GSDMD KO BMDMs的死亡率,IL-1β预处理BMDMs后再行白念珠菌刺激,观测BMDMs死亡率是否较单纯白念珠菌感染组下降。研究结果1.烟曲霉体外刺激可引起小鼠巨噬细胞LC3-Ⅱ表达水平随时间逐渐升高,各溶酶体阻断剂处理后可使LC3-Ⅱ水平进一步升高。2.体外实验证明烟曲霉感染巨噬细胞后,巨噬细胞可以出现焦亡特征性表现,而敲除GSDMD后,无法诱导焦亡发生。3.在体实验中,小鼠系统感染烟曲霉后,与GSDMD KO小鼠相比,WT小鼠存活率更高、脏器菌载量更低;WT小鼠多个脏器均发生焦亡;WT小鼠脾脏巨噬细胞发生炎症小体活化及焦亡,而GSDMD敲除小鼠未发生上述变化。4.分别抑制 NLRP3、caspase-1、Dectin-1、TLR2、TLR4、NF-κB、ERK 1/2 后,再行烟曲霉体外刺激THP-1巨噬样细胞,发现焦亡被抑制。5.白念珠菌体外刺激可引起小鼠巨噬细胞焦亡,而敲除GSDMD后,无法诱导焦亡发生;与WT组相比,GSDMD KO组巨噬细胞对白念珠菌的吞噬率更低,死亡率更高;IL-1β预处理巨噬细胞后再行白念珠菌刺激,可使巨噬细胞死亡率降低。研究结论1.烟曲霉体外刺激可增加小鼠巨噬细胞基础自噬流。2.烟曲霉可以诱导巨噬细胞发生焦亡,敲除GSDMD后,无法诱导焦亡发生;烟曲霉系统感染可以诱导小鼠焦亡发生,且焦亡可能发挥了抗感染保护作用。3.NLRP3-caspase-1-GSDMD是烟曲霉诱导巨噬细胞焦亡的炎症小体通路,烟曲霉诱导巨噬细胞焦亡可能通过Dectin-1/TLR2/TLR4受体激活巨噬细胞,并传递信号,激活其下游NF-κB通路、ERK 1/2丝分裂原活化蛋白激酶(VX-765MAPK)通路蛋白,从而激活焦亡。4.白念珠菌可诱导巨噬细胞发生焦亡;焦亡的发生可促进IL-1β释放,并通过提高巨噬细胞的免疫活性,降低巨噬细胞死亡率。

经肉桂酸修饰的新型萘普生衍生物的设计、合成及抗炎作用研究

过度的炎症给患者带来痛苦,严重可致亡。萘普生作为一种非甾体抗炎药,可有效缓解过度的炎症反应,但长期服用会导致诸多不良反应的发生。为adoptive immunotherapy了得到抗炎活性优良且毒副作用更小的新型抗炎药物,受肉桂酸生物活性多样性和安全低毒性的启发,本文以S-(+)-萘普生为基本骨架,利用肉桂酸及其类似物对其进行结构修饰,并通过体外生物活性测试和作用机制研究,以期得到高效低CX-5461毒的新型抗炎药物。利用肉桂酸及其类似物,通过Steglich酯化反应,对S-(+)-萘普生这一基本骨架进行结构修饰,合成得到三个系列共88个新型化合物,并对其物理性质和化学结构进行表征,以确证化合物的纯度和结构。然后,建立LPS诱导RAW 264.7细胞体外炎症模型,并利用该模型对给药浓度为50μM的新型化合物进行抑制NO释放活性初筛和IC_(50)测试。与此同时,利用MTT法对化合物进行RAW 264.7细胞毒性测试。接着,从每个系列中分别选取一个活性最好且Z-VAD-FMK研究购买毒性较小的化合物,通过Western Blotting实验研究其抗炎机理。最后,通过分子对接软件Sybyl-X 2.0模拟其与炎症因子的结合情况。经表征,确证了88个新型化合物的化学结构,且纯度较高。经体外抗炎实验和细胞毒性测试,筛选出十个高效低毒的抗炎活性小分子(化合物10、23、26、28、53、58、68、73、86和87)。抗炎机理研究表明,在每个系列中抑制NO释放活性最好的化合物23、53和68对NF-κB通路具有一定的阻断作用,并抑制了NLRP3炎症小体和i NOS、COX-2和IL-1β三种炎症因子的过度表达。分子对接结果表明,该三个化合物均可嵌入该三种炎症因子的活性口袋,与每种炎症因子产生一定的相互作用力。本文合成的新型化合物23、53和68具有高效低毒的特点,可有效阻断NF-κB信号通路,以及抑制NLRP3炎症小体和i NOS、COX-2和IL-1β三种炎症因子的过度表达,从而抑制NO的释放。本文通过天然活性小分子修饰抗炎药物的合成策略有望为新型抗炎药物的研发提供新思路。

胆囊胆固醇结石与SR-B1单核苷酸多态性及环境因素的关联性研究

目的:通过临床病例对照研究的方法,探究SR-B1基因(rs5888和rs838880)在胆囊胆固醇结石患者中的表达及遗传多态性,分析胆囊胆固醇结石患者SR-B1基因的基因位点与血脂指标及性别、民族、环境因素等是否存在差异和关联性进行研究。方法:随机选取我科入院行择期腹腔镜胆囊切除术患者共200例,按照入组标准将胆囊胆固醇结石组(100例)作为病例组;非胆囊结石组(100例)作为对照组,提取所有受试者外周静脉血DNA,应用直接测序法对病例组及对照组试受者的SR-B1基因(rs5888、rs838880)进行SNP分型检测,比较俩组中SR-B1基因(rs5888、rs838880)基因型频率及等位基因频率的差异,探究俩组之间是否存在关联,同时分析胆囊胆固醇结石患者SR-B1基因的基因位点与血脂指标及性别、民族、环境因素的关联性。结果:1.病例组中血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TCH)、低密度脂蛋白(LDL)、载脂蛋白B(Apo-B)水平显著高于对照组;高密度脂蛋白(HDL)、载脂蛋白AI(Apo-AI)水平显著低于对照组(P<0.05)。2.SR-B1基因rs5888位点的等位基因频率、基因型频率在病例组和对照组中的分布差异有统计学意义(P<0.05);两组中等位基因C和T的频率分布差异有统计学意义(P<0.05)。病例组内SR-B1基因rs5888位点的CC基因型者明显高于CT+TT基因型(P<0.05),表明突变基因型CC可能是胆囊胆固醇结石的危险因素(OR=2.279)。C等位基因频率高于T等位基因,表明C等位基因可能增加了胆囊胆固醇结石的患病风险(OR=1.898),病例组中TT型基因者基因频率明显低于对照组,TT型基因者HDL-C明显高于CC和CT型,而TG、TCH含量则较CC和CT型明显偏低(P<0.05),LDL、Apo-AI、Apo-B和Apo-AI/Apo-B差异无统计学意义(P>0.05)。3.SR-B1基因rs838880的等位基因频率、基因型频率在病例组和对照组中的分布差异有统计学意义(P<0.05)。病例组SR-BMCC950细胞培养1基因rs838880位点的CC型者显著少于对照组,这表明SR-Medicago lupulinaB1基因rs838880位点的基因型CC是保护基因型。病例组中TT基因型者的TCH明显高于TC、CC型,差异有统计学意义(P<0.05)。该组中CC型基因者HDL明显高于TC、TT型,差异有统计学意义(P<0.05)。这表明C等位基因可能与血中的HDL-C的升高有关。TG、LDL、Apo-AI和Apo-B差异无统计学意义(P>0.05)。4.有胆囊胆固醇家族病史(OR=63.623)、喜食甜品(OR=40.405)是胆囊胆固醇结石发生的危险因素(均P<0.05);有饮茶习惯(OR=0.000)、有运动习惯(OR=0.001)、有饮食早餐习惯(OR=0.001)是胆囊胆固醇结石发生的保护性因素(P<0.05)。5.基因型(SR-B1基因rs5888)为CC型的患者有胆囊胆固醇结石家族史比无胆囊胆固醇结石家族史更容易患胆囊胆固醇结石(OR=1.335)。有饮茶习惯且基因型(S R-B1基因rs5888)为CC型的患者较无饮茶习惯且基因型为(SR-B1基因rs5888)CC型患病风险降低了84.7%(OR=0.153)。基因型(SR-B1基因rs5888)为CC型的患者有饮食早餐习惯较无饮食早餐习惯者患病风险降低了49.6%(OR=0.504)(均P<0.05)。基因型(SR-B1基因rs838880)为CC型的患者有饮茶习惯比无饮茶习惯更容易患胆囊胆固醇结石(OR=9.765)。有运动习惯且基因型(SR-B1基因rs838880)为CC型的患者较无运动习惯且基因型(SR-B1基因rCaspase抑制剂s838880)为CC型患病风险更高(OR=48.000)。基因型(SR-B1基因rs838880)为TC和TT型的患者喜食甜品较不喜食甜品者患病风险提高了30.0%(OR=1.300)。对于基因型(SR-B1基因rs838880)为TC和TT型的患者,有饮食早餐习惯者较无饮食早餐习惯者患病风险降低了21.4%(OR=0.786),(均P<0.05)。结论:1.SR-B1基因rs5888的基因型CC型可能是胆囊胆固醇结石发生的危险基因型。2.SR-B1基因rs838880的基因型CC型可能为胆囊胆固醇结石的保护基因型,C等位基因可能与血中HDL-C的升高有关。3.SR-B1基因的单核苷酸多态性与血脂及脂蛋白代谢异常有明显相关性。4.胆囊胆固醇结石患者存在不同程度的血脂及脂蛋白代谢异常。5.有胆囊胆固醇结石家族病史、喜食甜品是胆囊胆固醇结石发生的危险因素;有饮茶习惯、有运动习惯及有饮食早餐习惯是胆囊胆固醇结石发生的保护因素。6.基因因素与环境因素的交互作用促进了胆囊胆固醇结石的发生。

胆囊胆固醇结石与SR-B1单核苷酸多态性及环境因素的关联性研究

目的:通过临床病例对照研究的方法,探究SR-B1基因(rs5888和rs838880)在胆囊胆固醇结石患者中的表达及遗传多态性,分析胆囊胆固醇结石患者SR-B1基因的基因位点与血脂指标及性别、民族、环境因素等是否存在差异和关联性进行研究。方法:随机选取我科入院行择期腹腔镜胆囊切除术患者共200例,按照入组标准将胆囊胆固醇结石组(100例)作为病例组;非胆囊结石组(100例)作为对照组,提取所有受试者外周静脉血DNA,应用直接测序法对病例组及对照组试受者的SR-B1基因(rs5888、rs838880)进行SNP分型检测,比较俩组中SR-B1基因(rs5888、rs838880)基因型频率及等位基因频率的差异,探究俩组之间是否存在关联,同时分析胆囊胆固醇结石患者SR-B1基因的基因位点与血脂指标及性别、民族、环境因素的关联性。结果:1.病例组中血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TCH)、低密度脂蛋白(LDL)、载脂蛋白B(Apo-B)水平显著高于对照组;高密度脂蛋白(HDL)、载脂蛋白AI(Apo-AI)水平显著低于对照组(P<0.05)。2.SR-B1基因rs5888位点的等位基因频率、基因型频率在病例组和对照组中的分布差异有统计学意义(P<0.05);两组中等位基因C和T的频率分布差异有统计学意义(P<0.05)。病例组内SR-B1基因rs5888位点的CC基因型者明显高于CT+TT基因型(P<0.05),表明突变基因型CC可能是胆囊胆固醇结石的危险因素(OR=2.279)。C等位基因频率高于T等位基因,表明C等位基因可能增加了胆囊胆固醇结石的患病风险(OR=1.898),病例组中TT型基因者基因频率明显低于对照组,TT型基因者HDL-C明显高于CC和CT型,而TG、TCH含量则较CC和CT型明显偏低(P<0.05),LDL、Apo-AI、Apo-B和Apo-AI/Apo-B差异无统计学意义(P>0.05)。3.SR-B1基因rs838880的等位基因频率、基因型频率在病例组和对照组中的分布差异有统计学意义(P<0.05)。病例组SR-BMCC950细胞培养1基因rs838880位点的CC型者显著少于对照组,这表明SR-Medicago lupulinaB1基因rs838880位点的基因型CC是保护基因型。病例组中TT基因型者的TCH明显高于TC、CC型,差异有统计学意义(P<0.05)。该组中CC型基因者HDL明显高于TC、TT型,差异有统计学意义(P<0.05)。这表明C等位基因可能与血中的HDL-C的升高有关。TG、LDL、Apo-AI和Apo-B差异无统计学意义(P>0.05)。4.有胆囊胆固醇家族病史(OR=63.623)、喜食甜品(OR=40.405)是胆囊胆固醇结石发生的危险因素(均P<0.05);有饮茶习惯(OR=0.000)、有运动习惯(OR=0.001)、有饮食早餐习惯(OR=0.001)是胆囊胆固醇结石发生的保护性因素(P<0.05)。5.基因型(SR-B1基因rs5888)为CC型的患者有胆囊胆固醇结石家族史比无胆囊胆固醇结石家族史更容易患胆囊胆固醇结石(OR=1.335)。有饮茶习惯且基因型(S R-B1基因rs5888)为CC型的患者较无饮茶习惯且基因型为(SR-B1基因rs5888)CC型患病风险降低了84.7%(OR=0.153)。基因型(SR-B1基因rs5888)为CC型的患者有饮食早餐习惯较无饮食早餐习惯者患病风险降低了49.6%(OR=0.504)(均P<0.05)。基因型(SR-B1基因rs838880)为CC型的患者有饮茶习惯比无饮茶习惯更容易患胆囊胆固醇结石(OR=9.765)。有运动习惯且基因型(SR-B1基因rs838880)为CC型的患者较无运动习惯且基因型(SR-B1基因rCaspase抑制剂s838880)为CC型患病风险更高(OR=48.000)。基因型(SR-B1基因rs838880)为TC和TT型的患者喜食甜品较不喜食甜品者患病风险提高了30.0%(OR=1.300)。对于基因型(SR-B1基因rs838880)为TC和TT型的患者,有饮食早餐习惯者较无饮食早餐习惯者患病风险降低了21.4%(OR=0.786),(均P<0.05)。结论:1.SR-B1基因rs5888的基因型CC型可能是胆囊胆固醇结石发生的危险基因型。2.SR-B1基因rs838880的基因型CC型可能为胆囊胆固醇结石的保护基因型,C等位基因可能与血中HDL-C的升高有关。3.SR-B1基因的单核苷酸多态性与血脂及脂蛋白代谢异常有明显相关性。4.胆囊胆固醇结石患者存在不同程度的血脂及脂蛋白代谢异常。5.有胆囊胆固醇结石家族病史、喜食甜品是胆囊胆固醇结石发生的危险因素;有饮茶习惯、有运动习惯及有饮食早餐习惯是胆囊胆固醇结石发生的保护因素。6.基因因素与环境因素的交互作用促进了胆囊胆固醇结石的发生。

酶激活有机荧光探针的构建及其在肝脏疾病诊断中的应用

大多数疾病的发生都会伴随着某些生物活性分子的异常表达,因此众多具有标志性的生物活性分子在疾病的诊断和治疗过程中发挥着极其重要的作用。随着人们对超高灵敏度、实时成像检测需JQ1求的增长,具有高选择性、良好生物相容性、反应迅速、操作简便、灵敏度高、无创等优势的荧光探针,在疾病早期诊断和治疗以及生物体实时成像中显示出巨大的潜力。本文构建了两种新型小分子荧光探针,能够在对生物系统产生最小不良影响的情况下实现对某些生物活性分子的高灵敏度和高选择性检测。具体研究内容如下:(Vorinostat1)γ-谷氨酰转移酶(GGT)广泛存在于活细胞中,并在许多肿瘤组织中过表达。因此,它通常被认为是检测肿瘤,特别是肝癌的重要生物标志物。准确测定其活性有助于相关疾病的早期诊断和治疗。本工作以丹磺酰胺为荧光团,设计合成了一种基于谷氨酰胺键的“开启”型荧光探针NSA-GGT用于检测GGT活性。该探针具有良好的水溶性,能很好地分散在水溶液中。在磷酸盐缓冲液中与GGT孵育后,探针NSA-GGT在~523 nm处的荧光增加了25倍以上。这种传感模式对GGT活性检测显示出较好的灵敏度,并且在细胞内GGT荧光成像方面有良好的表现。后续的生物学实验表明,探针NSA-GGT还可用于活细胞和动物组织中GGT活性的荧光Biosafety protection成像。(2)黑色素瘤原发于表皮和真皮交界处,多出现于皮肤、眼部等部位,其恶性程度高、易转移,肝、肺、骨、腹膜后为转移多发部位。肝脏黑色素瘤是一种极难诊断、致死率极高的恶性肿瘤,目前并没有一种系统性的诊疗标准,基于此我们首次开发了一种基于酶级联反应检测生物体内BChE与TYR活性的近红外小分子荧光探针MB-BChE-TYR,用于肝脏黑色素瘤的早期诊断和术后评估。选用亚甲基蓝(Methylene blue)作为近红外荧光基团,引入对羟基苯乙胺与环丙基甲酸酯,分别作为酪氨酸酶(TYR)与丁酰胆碱酯酶(BChE)的特异性反应位点。而当TYR与BChE存在时,BChE催化酯键断裂,释放出MB-TYR,再经TYR的氧化成为醌,然后经历快速分子内环化导致脲键的自发水解,近红外荧光被激活。实验证实,探针MB-BChE-TYR可以通过荧光强度的变化实现对BChE与TYR的检测,进而实现对肝脏黑色素瘤的监测,有望成为肝脏黑色素瘤的早期诊断与术后评估的辅助治疗手段,提高患者的生存率。

羊踯躅叶抗类风湿性关节炎活性成分的筛选与鉴定

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)为一种无明确病因的对称性、慢性、自身免疫性炎症疾病,主要侵害人体四肢关节,导致关节处明显可见的红肿、僵直,甚至关节严重畸形,功能完全丧失,给患者带来了巨大的痛苦和精神折磨。一线治疗药物如非甾体抗炎药和皮质类固醇能够快速见效、短期效果好,但长期使用会带来不可承受的毒副作用。寻找更有效安全的药物显得格外重要。许多传统中药材因具有多靶点、毒副作用小、药用历史悠久等特点而被用于治疗类风湿性关节炎关节炎疾病,为治疗RA积累了巨大的药用样本和药用经验。羊踯躅(Rhododendron molle G.Don),一种广泛分布于中国南方地区的落叶灌木木本植物,其果实、根、花均可入药,具有麻醉镇痛、祛风除湿、散瘀杀虫等功效,在中医上具有治疗RA的悠久历史。现代药理学表明,它的果实、根、花都已具有良好的抗炎、抗RA活性。但对羊踯躅叶抗RA的研究十分有限,严重限制了羊踯躅的开发利用。本研究接着课题组的前期工作,围绕羊踯RAD001半抑制浓度躅叶替代传统药用部位治疗RA的潜力以及羊踯躅抗RA活性成分的筛选和鉴定展开实验。具体结果如下:通过细胞毒性实验探究羊踯躅不同药用部位的毒性作用,并确定后续实验的浓度范围。结果显示,高浓度(≥150μg/mL)时,羊踯躅叶的毒性作用比花和果实的高。但浓度为100μg/mL时,其对RAW 264.7细胞的毒性与花和果实的相比,差异不明显。在GC-MS分析中,在羊踯躅叶中共检测到了834种化合物。其中萜类化合物最多,有224种,酮类化合物有72种。羊踯躅各药用部位化合物的种类和数量差别不大,但化合物含量占比不同。高效液相色谱显示,羊踯躅叶、花和果实的洗脱组分大致相同,说明它们的成分差异不大。从毒性和组分差异的角度来看,羊踯躅叶具有替代花和果实作为筛选抗RA活性成分的潜力。前期的细胞实验和动物实验验证了羊踯躅叶的甲醇总提取物对细胞炎症模型具有很强的抗炎活性,而且能显著抑制佐剂性关节炎大鼠的爪关节肿胀、降低关节炎指数。细胞毒性实验显示,目标Biotin cadaverine组分对细胞没有明显的毒性作用。使用脂多糖刺激RWA 264.7细胞构建炎症模型。实时荧光定量结果显示,当目标组分浓度KPT-330使用方法为100μg/m L时,炎症相关基因(TNF-α、IL-6、IL-1β和COX-2)表达水平分别降低了63.82%,80.44%,71.22%,80.46%,NO的生成量则降低了78.93%,表现出了良好的抗炎活性。通过UHPLC-Q-TOF-MS分析,初步鉴定了目标化合物中含有11种黄酮类化合物和18种萜类化合物。接着,对目标组分进行分离纯化,从中分离出了4个单体化合物。通过核磁质谱分析鉴定出了2个化合物的结构,分别是槲皮苷和槲皮素3’-O-葡萄糖,都属于黄酮类化合物,与UHPLC-Q-TOFMS分析结果相一致。分子对接实验显示,槲皮苷与人源炎症蛋白(TNF-α、IL-6、IL-1β、COX-2和NF-κB)具有较强的相互作用,特别是与IL-1β,这可能是其抗炎活性的重要基础。本研究结果表明羊踯躅叶具有替代花和果实作为治疗RA药用部位的潜力,羊踯躅叶中的黄酮类化合物是潜在的抗RA活性成分,为后续羊踯躅叶的临床应用和药物开发提供了实验支持。

柚皮苷调节JAK2/STAT3信号通路对急性缺血性脑梗死大鼠神经损伤的影响

目的:观察柚皮苷通过调节蛋白酪氨酸激酶2(JAK2)/信号转导子与激活子3(STAT3)信号通路对急性缺血性脑梗死大鼠神经损伤的影响。方法:将60只大鼠分为对照组、假手术组、模型组、模型+生理盐水组、模型+柚皮苷组和模型+柚皮苷+白细胞介素(IL)-6组,每组10只大鼠。采用大脑中动脉闭塞(MCAO)法建立急性缺血性脑梗死模型。术后24 h对神经功能进行评分,测定脑梗死面积,观察脑组织病理形态;干/湿法检测脑水肿;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测JAK2/STAT3信号通路蛋白及Bax、Bcl-2蛋白表达;末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(TUNEL)检测脑细胞凋亡;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氧化应激因子[过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)]和炎性因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1β、IL-6]。结果:与对照组和假手术组比较,模型组大鼠神经功能缺损评分、水肿指数升高,脑梗死面积增加,细胞排列紊乱,细胞间隙变宽,细胞空泡增多,细胞变性,细胞染色不均匀,变性细胞指数(DCI)、Bax、凋亡指数(AI)表达、Bax/Bcl-2比值、MDA含量、血清TNF-α、IL-1β、IL-6、磷酸化JAK2(p-JAK2)、磷酸化STAT3(p-STAT3)表达升高,凋亡细胞呈深褐色,Bcl-2表达、CAT、SOD和GSH-Px活性降低(P<0.05);与模型组和模型+生理盐水组比较,模型+柚皮GNE-140供应商苷组大鼠神经功能缺损评分、水肿指数降低,脑梗死面积减小,细胞排列有序,细胞间隙少,细胞空泡少,细胞变性和细胞染色不均有所缓解,DCI、Bax、AI表达、Bax/Bcl-2比值、MDA含量、血清TNF-α、IL-1β、IL-6、p-JAK2、p-STAT3表达减少,深褐色凋亡细胞较少,Bcl-2表达、CAT、SOD和GSH-Px活性升高(P<0.05);与模型+柚皮苷组比较,模型+柚皮苷+IL-6组大鼠神经功能缺损评分、水肿指数升高,脑梗死面积增加,细胞排列紊乱,细胞间隙和空泡增多,细胞变性且染色不均,DCI、Bax、AI表达、Bax/Bcl-2比值、MDA含量、血清TNF-α、IL-1β、IL-6、p-JAK2、p-STAT3表达升高,深褐色凋亡细胞增多,Bcl-2表达、CAT、SOD和GSH-Px活性降低(P<0.social impact in social media05)。结论:柚皮苷对急性缺血性脑梗死大鼠神经损伤有保护作用,其机制可能与抑制JAK2/PLX4032供应商STAT3信号通路及氧化应激、炎症和细胞凋亡有关。

纳米气泡行为的热力学和动力学理论研究

在化工生产和日常生活中,常常伴随着纳微流体结构的形成与消失,如微流控中纳米气泡的产生、雾霾中微液滴的成核和潜水病中微细气泡的形成。这些细微流体结构对相关的化学、物理、生物过程有着重要影响。尤其是纳米尺寸的气态结构,近年来逐渐成为研究的热点,并已经在很多领域取得广泛应用。尽管大量的实验都观测到长时间(几小时到几周)稳定的纳米气泡,但是其热力学稳定性却与经典理论相冲突。这说明与纳米气泡有关的理论和性质,还有很大一部分没有被人们所理解。为了进一步揭示这些尚未被发掘的纳米气泡相关的基本规律,本文采用热力学理论、动力学理论和分子动力学模拟相结合的方法,来探究纳米尺度下气泡的形成、稳定与溶解过程。研究的主要内容包括:1.理论上探究表面活性剂对纳米气泡稳定性的影响。这部分内容主要采用热力学分析法,构建演化路径,利用自由能取极值的方法寻找纳米气泡稳定态的可能。研究表明表面活性剂在气泡气-液界面上的吸附不仅会改变气泡的界面张力,而且在一定条件下导致自由能局部极小的出现。这说明表面活性剂的吸附对纳米气泡的稳定性起着至关重要的作用。除了热力学方法,论文还采用了E-P方程探究气泡演化的动力学过程。结果发现,当存在表面活性剂吸附,纳米气泡也存在动力学稳定解。此外,分子动力学模拟结果也证实了一定量的表面活性剂在气泡界面上的吸附可以稳定体相纳米气泡,这再次证明了表面活性剂对纳米气泡稳定性的重要影响。2.表面活性剂单层对纳米气泡稳定性的影响。尽管之前的理论研究表明,一定的气体过饱和度下,表面活性剂的吸附可以稳定纳米气泡。但在很多实验条件下,纳米气泡的稳定却不需要气体过饱和的环境,例如在敞开的大气环境下,长时间稳定的纳米气泡也能被观测到。根据纳米气泡和微乳液的实验观测中出现的诸多相似性,论文中提出了一个新的观点:稳定的体相纳米气泡可视为微乳液的气态类似物。论文指出,在低气体过饱和的环境中,气泡界面形成了一层紧密的表面活性剂单层,也称之为压缩单层。这种压缩单层具有超低(接近0)的界面张力。因此,在这种情况下稳定纳米气泡不需要气体的过饱和。这种压缩单层模型,也存在于稳定的微乳液体系中,只是把微乳液中的油相换成了纳米气泡中的气相。所以,可将体相纳米气泡视为微乳液的气态类似物。其中,压缩单层很可能来源于大气泡的收缩,并且压缩单层的刚度对纳米气泡的尺寸有重要影响。基于这个观点,论文对纳米气泡稳定性的进行了详细地热力学分析。3.表面活性剂混合物在降低气-液界面张力中的协同机制。论文采用分子动力学模拟探究了双组分表面活性剂如何协同降低气-液界面的界面张力。模拟结果表明,在给定主表面活性剂的情况下,加入第二种表面活性剂要么进一步降低界面张力,表现出正的协同效应,要么增加界面张力,表现出负的协同效应。表面活性剂混合物在降MC3低表面张力上的协同作用,很大程度上取决于不同表面活性剂成分之间的结构互补,而不同的互补结构决定了表面活性剂单层的自发曲率。通过分析表面活性剂单层自发曲率与表面活性剂头部和尾部的平衡分布,结果显示,表面张力降低的正协同效应总是伴随着头部和尾部分布对称性增强;而负协同效应对应于头部和尾部分布的不对称趋势增强。此外,模拟结果表明,自发曲率接近零通常伴随着非常低的气-液界面张力。4.纳米尺度的软受限空间中的流体气液相变和相间振荡行为。纳米气泡构成了一个典型的软受限体系。在这个特别的体系中体积和压力都不是固定的,而且它们的变化依赖于受限空间的刚度α_K。因此流体在软受限空间中的相变行为不同于等体积(NVT)和等压力(NPT)空间。论文通过自由能分析研究了软受限空间中流体的相变行为。结果表明,在具有适中软硬度α_K(α_K是受限空间墙壁的弹性常数,与抵抗变形的能力成正比)时,体系的相变行为更丰富。在非常软的受限体系中只有两相(纯气相和纯液相),此时α_K→0,类似于NPT系综。而在适度软的受限体系中,出现了三相(纯气相、气相-液滴共存、纯液相)。此外,P-V曲线中的压力下降随着α_K的减小从不连续变为连续,并且P-V曲线在非常小的α_K时出现平台。随着α_K的降低,发生相变的〈V〉的宽度逐渐增加;α_K增大时(约束增强),体积的波动又会减弱。5.基底硬度对界面纳米气泡稳定性的影响。解释界面纳米气泡稳定的“接触线锚定-过饱和”机制引起了实验研究者的广泛关注,但有些实验表明有些情况下接触线锚定不是必需的。为解释这一现象,论文通过理论分析表明,软基底变形时产生的自锚定效应可以诱导界面纳米气泡的稳定。通过调节基底的软硬度,界面纳米气泡形成后可能在其接触线附近诱导基底产生不同变形的凸起。根据这种变形的大小,分析得出,在硬基底和液态(特别软)基底上,界面纳米气泡形成时自由能曲线只有局部极大值。但气泡在具有适中软硬度的基底上形成时,可能出现自由能局部极小值,这主要是由自锚定效应引起的。因此,通过改变基底的软硬度可以调节表面纳米气泡的稳定性。除了基底本身的软硬度之外,基底上吸附的表面3-MA浓度活性物质分子也可能诱导三相接触线处的自锚定效应,从而影响纳米气泡的稳定性。6.界面纳米气泡溶解行为的动力学研究。论文采用Onsager变分原理并结合E-P方程来研究界面纳米气泡演化过程,同时探究了表面活性剂的吸附对界面纳米气泡动力学行为的影响。研究结果表明,无量纲系数k_(di)(k_(di)=τ_(re)/τ_(di),其中τ_(re)为弛豫时间,τ_(di)为溶解时间)可plant bacterial microbiome以决定气泡的溶解模型;化学上的非均一性可以使气泡溶解过程出现stick-slip行为;表面活性剂吸附或接触线锚定都可以单独来稳定界面纳米气泡。

丁香酚纳米脂质体的制备及其抗大肠杆菌的作用研究

丁香酚(eugenol,Eug)是一种具有特殊香气的淡黄色酚类化合物,也是丁香油的主要活性成分。研究表明,Eug具有抗氧化、抗炎、抗菌、免疫调节、镇痛、抗癌等多种药理作用,且具有较好的安全性,美国食品和药物管理局(FDA)已将其纳入食品添加剂目录。但Eug存在挥发性高、水溶性差、稳定性和生物利用度低等缺陷,限制了其功效的发挥,因此亟需研发新的剂型来提高其应用效果。脂质体是一种可在水性介质中通过两性基团而发生自组装的双层囊泡载体系统。药物包CP-456773采购裹在脂质体囊泡后可增强其溶解度和稳定性,并减少药物降解。此外,脂质体的控释特性可以延长药物在血液中的循环时间,同时减小副作用,降低各类药物的靶向毒性。本研究采用薄膜水合超声法将Eug装载于脂质体中,制备了丁香酚纳米脂质体(eugenol nano-liposome,ENL),采用 Box-behnken 设计(BBD)响应面法优化了其制备工艺,对ENL形态结构和释放等性能进行了表征;然后评价了其对大肠杆菌(Eschericha coli,E.coli)的体内外抑菌效果,为Eug新型制剂的研发提供技术支撑。1.ENL的制备及BBD响应面法优化为解决Eug易挥发、难溶于水和不稳定等问题,采用薄膜水合超声法将其制备成ENL,并通过有机溶剂萃取法、破乳法计算ENL的实际包封率。为确定其制备条件,对ENL进行五因素五水平的单因素分析,分别为大豆卵磷脂与胆固醇的质量比(W/W)、Eug浓度(%)、吐温-80质量(mg)、水化温度(℃)、超声时间(min)。选取其中对包封率影响最大的前三个因素,以BBD响应面法优化制备工艺。结果显示:最佳制备工艺是大豆卵磷脂与胆固醇的质量比为5.4:1、Eug浓度为1.5%、超声时间为10 min。据此获得的包封率平均值为72.42±0.22%,与预测包封率72.51%接近。这表明,单因素分析结合BBD响应面法优化可以获得较高包封率的ENL。2.ENL的性能表征为表征ENL的性能,对其形态、粒径、多分散指数(PDI)、Zeta电位、傅里叶红外光谱(FTIR购买BYL719)、缓释性和稳定性进行了考察。通过透射电子显微镜(TEM)观察ENL的超微结构;使用纳米粒度分析仪测定其粒径大小和Zeta电位;以溴化钾(KBr)压片法扫描获得其红外光谱;模拟体内胃肠环境,采用透析法和紫外分光光度法测定ENL中Eug的体外释放量;将ENL分别置于4℃、25℃两种条件下45 d,分别测定其粒径及PDI变化来测定ENL的储存稳定性。结果表明:ENL的形态近似球形,大小均一;平均粒径为 203.97±8.66nm,PDI 为 0.23±0.03、Zeta 电位为-2.18±0.18mV;Eug 的特征峰在ENL中进行了红移和蓝移,可能是氢键相互作用;ENL在胃、肠模拟液中缓慢释放;并且在4℃和25℃两种条件下可稳定储存45 d。以上结果表明,薄膜水合超声法制备的ENL具有良好的稳定性和缓释性。3.ENL的体外抑菌作用研究为探究ENL对E.coli的体外抑菌作用,本试验采用微量肉汤稀释法和琼脂扩散法测定ENL对E.coli的最小抑菌浓度(MIC)及最小杀菌浓度(MBC);将ENL分别在4℃和25℃两种条件下放置0d、7d、15 d、30 d和45 d,检测其对E.coli的抑菌作用变化;通过酶标仪测定不同浓度药物处理后E.coli在不同时间段的OD600,并绘制生长曲线;使用2MIC、4MIC浓度的ENL在不同时间点分别处理E.coli,测定其菌落数,并绘制时间-杀菌曲线;使用扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)观察药物处理后E.coli的形态结构变化;将不同浓度药物处理后的E.coli与荧光探针1-N-苯基萘胺(NPN)、碘化丙啶(PI)共同处理后,通过荧光显微镜观察Ecoli细胞外膜和内膜的变化。结果显示:ENL对 E.coli菌株的MIC为0.31 mg/mL,MBC为0.63 mg/mL,抑菌效果比Eug增强了 2~4倍;45 d内ENL具有较好的抑菌稳定性,两种储存条件下的ENL对E.coli的MIC、MBC几乎没有变化;2MIC的ENL处理2 h可杀灭标准株ATCC25922,12 h可杀灭临床分离耐药株E.coliAHM5C23;4MIC的ENL处理4 min可杀灭标准株ATCC25922,10 min可杀灭临床分离耐药株E.coli AHM5C23。SEM和TEM结果发现,ENL处理后会引起菌体发生严重的皱缩、细胞膜破损、细胞壁和菌毛等结构消失;荧光显微镜结果表明,ENL可破坏E.coli的细胞外膜和内膜,增加其通透性,并呈现一定的药物浓度依赖性。以上结果表明,ENL对E.coli具有明显的抑杀作用,主要是通过破坏其细胞膜而引起的。4.ENL对E.coli性肠炎的治疗作用研究为探究ENL对E.coli性肠炎的体内治疗效果,本试验首先通过给BALB/c小鼠灌服临床分离耐药株E.coli(AHM5C23)建立肠炎模型,建模后使用不同浓度的ENL(5、10、20mg/kg)对其进行治疗,4d后将小鼠处死,病理解剖并采样,然后通过死亡率、体重和脏器指数、肠道组织病理变化和小肠吸收能力、肠道组织炎性细胞因子以及肠道组织炎症相关蛋白的表达,来判定ENL对E.coli感染性肠炎的治疗效果。结果表明:与空白组相比,模型组小鼠存活率为80%,体重明显下降,肝脾指数显著增加,回肠和结肠HE染色结果呈现明显的肿胀、肠壁变薄、绒毛萎缩、出血、炎性细胞浸润、绒隐比(V/C)显著降低等病理变化;ENL治疗组小鼠未出现死亡情况,上述症状明显改善。RT-qPCR检测发现,ENL治疗可明显抑制肠道组织炎症细胞因子NLRP3、IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达;Western blot检测证明,ENL治疗可显著抑制肠道组织炎症相关蛋白TLR4、MyD88、p-P65、p-IκB的表达。以上结果表明ENL具有明显的抗炎作用,可显著抑制细菌性肠炎所引起的NF-κB信号通路的过度激活,而发挥良好的治疗作用。综上所述,BBD响应面法优化制备条件后,可以得到较高包封率的ENL,其为大小均一的球形,具有较小的粒径、缓释性和储存稳定性。同时,ENL对多株耐药E.coli菌株具有明显抑制作用,并可在几分钟内杀灭细菌;这与其破坏菌体细胞膜使菌体发生皱缩和破lethal genetic defect损有关。此外,ENL抑制E.coli感染诱导的TLR4/MyD88/NF-κB信号通路活化,下调炎症细胞因子NLRP3、IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达而对E.coli感染性肠炎具有治疗作用。以上结果表明,ENL具有良好的体内外抑菌抗炎作用,有望成为一种新型替抗药物。