目的 研究探讨奥氮平联合氟伏沙明治疗精神分裂症伴抑郁患者其奥氮平使用剂量、N-去甲基奥氮平浓度、血清泌乳素水平的影响。方法 选取2021年1月～2022年11月本院收治的96例精神分裂症伴抑郁患者为对象，随机分为奥氮平治疗48例（对照组），奥氮平联合氟伏沙明治疗48例（观察组）。比较两组患者的临床疗效、奥氮平使用剂量、N-去甲基奥氮平浓度、血清泌乳素水平、治疗安全性等。结果 治疗后试验组总有效率为高于对照组（P<0.05）；试验组阳性与阴性症状量表（PANSS）量表中阴性和一般精神病理评分低ribosome biogenesis于对照组（P<0.05）；试验组汉密尔顿抑郁量表-17项（HAMD-17）评分低于对照组（P<0.05）；试验组奥氮平使用剂量、N-去甲基奥氮平、血清泌乳素均低于对照组（P<0.05）；两组不良反应发生率相近（P>0.05）。结论 ABT-199价格奥氮平联合氟伏沙明治疗能够改善精神分裂症伴抑郁的阴性症状和抑郁症状，奥Ipatasertib IC50氮平使用剂量更低，降低N-去甲基奥氮平和血清泌乳素水平，治疗安全性良好。
PLGA-PEG纳米粒子的制备及跨胎盘屏障细胞模型的转运机制研究
目的:目前,一些普遍存在的妊娠并发症,例如胎儿生长受限、先兆子痫、早产等,影响超过1/6的妊娠,对母体和胎儿的生命健康构成严重威胁。但由于孕妇用药的特殊性,在过去20年中只有少数药物被批准用于孕期病症。纳米医学具有生物利用度高和靶向药物输送等优势,在围产期医学领域表现出巨大潜力。然而,由于纳米材料可能会蓄积于胎盘或通过胎盘屏障对胚胎发育产生影响,限制了其在该领域的研究与应用。聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic)acid,PLGA]纳米粒子作为药物载体受到越来越多的关注,但关于PLGA纳米粒子是如何经胎盘转运仍鲜有报道。基于此,本研究利用人绒毛膜癌BeWselleck产品o b30细胞建立胎盘屏障细胞模型,探讨PLGA纳米粒子在该模型中的转运情况及其可能涉及的机制,为调控纳米粒子跨胎盘转运提供理论基础。方法:(1)PLGA-PEG纳米粒子的制备及表征:采用乳化溶剂蒸发法制备PLGA-PEG纳米粒子,并利用化学反应和物理吸附的方法将异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记在其表面。通过纳米粒度电位仪测定PLGA-PEG纳米粒子的粒径、PDI和Zeta电位,透射电镜观察纳米粒子形貌,并考察其稳定性。(2)胎盘屏障细胞模型的构建:对BeWo b30细胞进行体外培养,通过MTT法绘制细胞生长曲线,并考察在不同接种量下BeWo b30细胞的HCG分泌。将BeWo b30细胞接种于Transwell小室,构建胎盘屏障细胞模型。通过检测跨膜电阻(transepithelial electrical resistance,TEER)、荧光素钠(sodium fluorescein,Na-Flu)表观通透率以及紧密连接蛋白(zona occludens 1GW-572016小鼠,ZO-1)染色等方法,对单层模型的完整性和有效性进行评估。(3)PLGA-PEG纳米粒子及内吞抑制剂对BeWo b30细胞的毒性:通过体外培养BeWo b30细胞,使用MTT法评估在不同浓度梯度下PLGA-PEG纳米粒子及内吞抑制剂对细胞的毒性。(4)通过荧光测定法量化PLGA-PEG纳米粒子的细胞摄取,并研究纳米粒子浓度、温度和孵育时间对摄取的影响,同时利用胎盘屏障细胞模型探究前期制备的PLGA-PEG纳米粒子是否能够穿越该模型。(5)探究内吞抑制剂制霉菌素(nystatin,NY)、菲律宾菌素III(Filipin III)、甲基-β-环糊精(methyl-β-cyclodextrin,MβCD)、氯丙嗪(chlorpromazine,CPZ)、秋水仙素(colchicine,CAortic pathologyol)和阿米洛利(amiloride,AMR)对BeWo b30细胞摄取和转运PLGA-PEG纳米粒子的影响,并检测PLGA-PEG纳米粒子和Col对BeWo b30细胞的磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶-3β(phosphoinositide-3-Kinase/protein kinase B/glycogen synthase kinase-3,PI3K/AKT/GSK3β)通路蛋白表达的影响。结果:(1)我们成功制备了标记有FITC的PLGA-PEG纳米粒子。该纳米粒子的粒径为186.60±7.46 nm,PDI为0.16±0.07,电位为+16.4±3.36 m V。该纳米粒子呈球形,分散性良好,粒径均匀,且具有良好的贮存和稀释稳定性。(2)细胞生长曲线显示,当以1×10~5个/cm~2的细胞密度接种后,在第2～6天,细胞处于增长趋势,与文献报道相符,并以此作为建模的接种密度。HCG分泌实验表明,随着细胞的分裂,HCG分泌量逐渐升高,其中以8万个/孔组HCG升高最为明显。TEER检测结果显示,在接种后的第5天,TEER值符合细胞单层模型的要求并在之后的48 h维持稳定(80Ω·cm~2?TEER?100Ω·cm~2);而Na-Flu表观通透率则在第5天降至极低水平,并在之后的48 h持续减少;ZO-1染色结果显示生长至第6天的细胞单层ZO-1表达完整连续,细胞骨架结构清晰。(3)PLGA-PEG纳米粒子在25～400μg/m L的浓度范围内对BeWo b30细胞没有明显细胞毒性(P?0.05)。NY(50μg/m L)、Filipin III(1μg/m L)、MβCD(5 m M)、CPZ(7μg/m L)、Col(10μg/m L)和AMR(50μM)对BeWo b30细胞孵育4 h后结果表明没有明显细胞毒性(P?0.05)。(4)BeWo b30细胞对PLGA-PEG纳米粒子的摄取具有浓度/温度/时间依赖性。PLGA-PEG纳米粒子能够跨越胎盘屏障细胞模型,转运量与孵育时间呈正相关。(5)在摄取实验中,Col、AMR和MβCD对PLGA-PEG纳米粒子的摄取抑制率分别为68.13%、60.15%和46.44%,它们对PLGA-PEG纳米粒子的摄取的影响显著(P<0.01或P<0.001),激光共聚焦图像提供了可视化证实。在转运实验中,Col、AMR和MβCD对PLGA-PEG纳米粒子的转运抑制率分别达到37.34%、15.32%和14.26%,它们对PLGA-PEG纳米粒子的转运的影响显著(P<0.001)。免疫蛋白印迹实验显示,在PLGA-PEG纳米粒子刺激下,BeWo b30细胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-GSK3β/GSK3β的蛋白表达水平增加,而Col可以抑制BeWo b30细胞对于PLGA-PEG纳米粒子刺激引起的蛋白表达水平增加。结论:制备的PLGA-PEG纳米粒子平均粒径为186.60 nm,呈球形,分散性良好,粒径均匀,且具有良好的稳定性。BeWo b30细胞具有胎盘滋养层细胞的特性,利用其构建的胎盘屏障细胞模型阻滞效果好,连接紧密。BeWo b30细胞摄取PLGA-PEG纳米粒子呈浓度、温度、时间依赖性。PLGA-PEG纳米粒子能够穿过胎盘屏障细胞模型,其进入BeWo b30细胞主要通过巨胞饮作用,其次是小窝蛋白介导的内吞作用,并受到PI3K/Akt/GSK3β信号通路的调节。本研究对于调控制纳米药物的经胎盘转运,提高孕妇用药的安全性具有重要的现实意义。
发酵过程中腐乳鲜味物质快速定量检测方法及其品质分析
腐乳作为我国传统发酵食品的重要组成部分,因其风味独特、滋味鲜美、营养价值高等优点而深受广大消费者的喜爱。天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、5′-肌苷酸(5′-IMP)、5′-鸟苷酸(5′-GMP)是腐乳呈鲜味的重要氨基酸和核苷酸,对腐乳的滋味品质有重要影响。常见鲜味物质的检测方法存在样品前处理复杂、仪器检测条件苛刻、价格昂贵、检测时间长等缺点。因此,寻找快速定量检测发酵食品鲜味物质的方法变得尤为重要。此外,消费者对腐乳的接受度依赖于外在和内在因素,外在因素有价格和品牌信誉等,内在因素如营养、口味、外观等,则与腐乳的物理化学等特性有关。食品的物理化学特性常受到外界因素的影响,如生产工艺、生产和贮藏环境条件等。发酵是腐乳生产过程中的重要环节之一,伴随着多种复杂的物理化学反应,为了更好地对腐乳品质进行分析和控制,需要系统而全面地了解腐乳发酵过程中的成分变化及其相互作用关Immune trypanolysis系。因此,本研究基于电化学机理以及鲜味物质结构分析,分别制备能够对鲜味氨基酸和核苷酸进行快速定量检测的电化学传感器装置,并将其应用于实际腐乳样品鲜味物质的检测中。同时,对发酵过程中腐乳的理化品质变化特征及其相关性进行研究,以期为腐乳品质分析及改善提供理论依据和支撑。本文的主要研究内容和结果如下:(1)针对发酵过程中腐乳鲜味氨基酸检测的N,N’-二苯基硫脲(DPTU)膜修饰传感器的应用研究。采用氨基酸分析仪对腐乳发酵过程中的氨基酸进行检测,结果共检测到16种游离氨基酸(FAAs),其中鲜味氨基酸占FAAs总量的40.51%。基于DVX-661 MWPTU类似路易斯碱结构和能够吸收电子云或者相应的原子团的特性,采用DPTU膜修饰传感器,探究开路电位值与标准品鲜味Glu和Asp浓度之和的数学关系,并将其应用于实际样品腐乳发酵过程中鲜味氨基酸的检测。试验结果表明该传感器可以对腐乳中的鲜味Glu和Asp浓度之和进行定量检测。(2)针对5′-IMP检测的聚甲硫氨酸(P Met)膜修饰传感器的研究及应用。采用电化学聚合的方法,利用氨基酸化合物之间的特异性吸附,制备针对5′-IMP检测的P Met膜修饰传感器。通过物理和电化学表征,试验结果表明P Met膜修饰传感器可以实现对5′-IMP的特异性吸附。采用差分脉冲伏安法(DPV)和循环伏安法(CV)对P Met膜修饰传感器检测5′-IMP的条件参数进行优化,并对不同浓度的5′-IMP标准品进行检测,结果表明,P Met膜修饰传感器对5′-IMP响应的氧化峰电流值与其浓度呈现良好的线性关系,具体为:在1～15μmol/L的5′-IMP浓度范围内,线性方程为I_1=0.1036(±0.0049)C_1+2.8035(±0.0235),相关系NSC 127716使用方法数为0.9926;在15～500μmol/L的5′-IMP浓度范围内,线性方程为I_2=0.0023(±0.0001)C_2+4.3135(±0.0267),相关系数为0.9938。检测下限为0.3367μmol/L(S/N=3)。试验结果表明,P Met膜修饰传感器在抗干扰性、重现性和稳定性方面性能良好,可用在腐乳样品5′-IMP的特异性检测中。(3)针对5′-GMP检测的分子印迹传感器的研究及应用。以5′-GMP为模板分子,邻苯二胺(OPD)为单体,通过电化学聚合OPD和沉积纳米银(Ag NPs)的方法在羧基化多壁碳纳米管(SMWCNTs)修饰的玻碳电极(GCE)上构建针对5′-GMP检测的分子印迹传感器(Ag NPs/SMWCNTs/MIP/GCE)。通过物理和电化学表征,试验结果表明该分子印迹传感器可以实现对5′-GMP的特异性检测。采用DPV法对该传感器检测条件参数进行优化,并对不同浓度的5′-GMP标准品进行检测,结果表明,该分子印迹传感器对5′-GMP响应的氧化峰电流值与其浓度对数呈现良好的线性关系,具体为:线性方程为I_3=0.5557(±0.0197)lg C_3+8.3996(±0.1995),检测范围为0.05～50.00 mmol/L,相关系数为0.9938,检测下限为0.009 mmol/L(S/N=3)。试验结果表明,该分子印迹传感器在抗干扰性、重现性和稳定性方面性能良好,可用在腐乳样品5′-GMP的特异性检测中。此外,该传感器将分子印迹与电化学传感器相结合,不仅实现了传感器对5′-GMP的特异性检测,同时还使用快速简便的电化学聚合单体方法,增加了模板分子的结合位点,从而间接提高了传感器的检测效率。(4)发酵过程中腐乳理化成分变化特征及其相关性分析。对发酵过程中腐乳的多项理化指标如营养指标(粗蛋白、粗脂肪、还原糖、氨基酸态氮、总酸、盐分和水分)、鲜味指标(Glu、Asp、5′-IMP和5′-GMP)、质构指标(硬度、粘性、弹性、内聚性、胶着性和咀嚼性)、颜色指标(明度、红度和黄度)和其他指标(电导率、浊度和p H值)等进行了动态的测定及分析,揭示了腐乳在发酵过程中的成分变化规律及原因,并对腐乳发酵过程中不同发酵阶段腐乳坯的营养组分与鲜味、质构、颜色、电化学等特征进行了相关性研究,具体为Glu与总酸呈显著正相关(P<0.05);Asp与总酸、还原糖呈极显著正相关(P<0.01),与粗蛋白、粗脂肪呈极显著负相关(P<0.01);5'-IMP与食盐呈极显著正相关(P<0.01);5'-GMP与食盐呈极显著正相关(P<0.01)。硬度、粘性、弹性、内聚性、胶着性、咀嚼性与粗蛋白和粗脂肪呈极显著正相关(P<0.01),与氨基酸态氮和总酸呈极显著负相关(P<0.01),与还原糖呈负相关。L*与粗蛋白、粗脂肪呈极显著正相关(P<0.01),与氨基酸态氮、总酸呈极显著负相关(P<0.01);a*与水分呈显著负相关(P<0.05),;b*与氨基酸态氮、总酸呈极显著正相关(P<0.01),与粗蛋白、粗脂肪呈极显著负相关(P<0.01)。浊度与水分呈显著负相关(P<0.05);电导率与食盐、氨基酸态氮、总酸呈正相关,与粗蛋白、粗脂肪、水分呈负相关;p H值与食盐呈正相关。
发酵过程中腐乳鲜味物质快速定量检测方法及其品质分析
腐乳作为我国传统发酵食品的重要组成部分,因其风味独特、滋味鲜美、营养价值高等优点而深受广大消费者的喜爱。天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、5′-肌苷酸(5′-IMP)、5′-鸟苷酸(5′-GMP)是腐乳呈鲜味的重要氨基酸和核苷酸,对腐乳的滋味品质有重要影响。常见鲜味物质的检测方法存在样品前处理复杂、仪器检测条件苛刻、价格昂贵、检测时间长等缺点。因此,寻找快速定量检测发酵食品鲜味物质的方法变得尤为重要。此外,消费者对腐乳的接受度依赖于外在和内在因素,外在因素有价格和品牌信誉等,内在因素如营养、口味、外观等,则与腐乳的物理化学等特性有关。食品的物理化学特性常受到外界因素的影响,如生产工艺、生产和贮藏环境条件等。发酵是腐乳生产过程中的重要环节之一,伴随着多种复杂的物理化学反应,为了更好地对腐乳品质进行分析和控制,需要系统而全面地了解腐乳发酵过程中的成分变化及其相互作用关Immune trypanolysis系。因此,本研究基于电化学机理以及鲜味物质结构分析,分别制备能够对鲜味氨基酸和核苷酸进行快速定量检测的电化学传感器装置,并将其应用于实际腐乳样品鲜味物质的检测中。同时,对发酵过程中腐乳的理化品质变化特征及其相关性进行研究,以期为腐乳品质分析及改善提供理论依据和支撑。本文的主要研究内容和结果如下:(1)针对发酵过程中腐乳鲜味氨基酸检测的N,N’-二苯基硫脲(DPTU)膜修饰传感器的应用研究。采用氨基酸分析仪对腐乳发酵过程中的氨基酸进行检测,结果共检测到16种游离氨基酸(FAAs),其中鲜味氨基酸占FAAs总量的40.51%。基于DVX-661 MWPTU类似路易斯碱结构和能够吸收电子云或者相应的原子团的特性,采用DPTU膜修饰传感器,探究开路电位值与标准品鲜味Glu和Asp浓度之和的数学关系,并将其应用于实际样品腐乳发酵过程中鲜味氨基酸的检测。试验结果表明该传感器可以对腐乳中的鲜味Glu和Asp浓度之和进行定量检测。(2)针对5′-IMP检测的聚甲硫氨酸(P Met)膜修饰传感器的研究及应用。采用电化学聚合的方法,利用氨基酸化合物之间的特异性吸附,制备针对5′-IMP检测的P Met膜修饰传感器。通过物理和电化学表征,试验结果表明P Met膜修饰传感器可以实现对5′-IMP的特异性吸附。采用差分脉冲伏安法(DPV)和循环伏安法(CV)对P Met膜修饰传感器检测5′-IMP的条件参数进行优化,并对不同浓度的5′-IMP标准品进行检测,结果表明,P Met膜修饰传感器对5′-IMP响应的氧化峰电流值与其浓度呈现良好的线性关系,具体为:在1～15μmol/L的5′-IMP浓度范围内,线性方程为I_1=0.1036(±0.0049)C_1+2.8035(±0.0235),相关系NSC 127716使用方法数为0.9926;在15～500μmol/L的5′-IMP浓度范围内,线性方程为I_2=0.0023(±0.0001)C_2+4.3135(±0.0267),相关系数为0.9938。检测下限为0.3367μmol/L(S/N=3)。试验结果表明,P Met膜修饰传感器在抗干扰性、重现性和稳定性方面性能良好,可用在腐乳样品5′-IMP的特异性检测中。(3)针对5′-GMP检测的分子印迹传感器的研究及应用。以5′-GMP为模板分子,邻苯二胺(OPD)为单体,通过电化学聚合OPD和沉积纳米银(Ag NPs)的方法在羧基化多壁碳纳米管(SMWCNTs)修饰的玻碳电极(GCE)上构建针对5′-GMP检测的分子印迹传感器(Ag NPs/SMWCNTs/MIP/GCE)。通过物理和电化学表征,试验结果表明该分子印迹传感器可以实现对5′-GMP的特异性检测。采用DPV法对该传感器检测条件参数进行优化,并对不同浓度的5′-GMP标准品进行检测,结果表明,该分子印迹传感器对5′-GMP响应的氧化峰电流值与其浓度对数呈现良好的线性关系,具体为:线性方程为I_3=0.5557(±0.0197)lg C_3+8.3996(±0.1995),检测范围为0.05～50.00 mmol/L,相关系数为0.9938,检测下限为0.009 mmol/L(S/N=3)。试验结果表明,该分子印迹传感器在抗干扰性、重现性和稳定性方面性能良好,可用在腐乳样品5′-GMP的特异性检测中。此外,该传感器将分子印迹与电化学传感器相结合,不仅实现了传感器对5′-GMP的特异性检测,同时还使用快速简便的电化学聚合单体方法,增加了模板分子的结合位点,从而间接提高了传感器的检测效率。(4)发酵过程中腐乳理化成分变化特征及其相关性分析。对发酵过程中腐乳的多项理化指标如营养指标(粗蛋白、粗脂肪、还原糖、氨基酸态氮、总酸、盐分和水分)、鲜味指标(Glu、Asp、5′-IMP和5′-GMP)、质构指标(硬度、粘性、弹性、内聚性、胶着性和咀嚼性)、颜色指标(明度、红度和黄度)和其他指标(电导率、浊度和p H值)等进行了动态的测定及分析,揭示了腐乳在发酵过程中的成分变化规律及原因,并对腐乳发酵过程中不同发酵阶段腐乳坯的营养组分与鲜味、质构、颜色、电化学等特征进行了相关性研究,具体为Glu与总酸呈显著正相关(P<0.05);Asp与总酸、还原糖呈极显著正相关(P<0.01),与粗蛋白、粗脂肪呈极显著负相关(P<0.01);5'-IMP与食盐呈极显著正相关(P<0.01);5'-GMP与食盐呈极显著正相关(P<0.01)。硬度、粘性、弹性、内聚性、胶着性、咀嚼性与粗蛋白和粗脂肪呈极显著正相关(P<0.01),与氨基酸态氮和总酸呈极显著负相关(P<0.01),与还原糖呈负相关。L*与粗蛋白、粗脂肪呈极显著正相关(P<0.01),与氨基酸态氮、总酸呈极显著负相关(P<0.01);a*与水分呈显著负相关(P<0.05),;b*与氨基酸态氮、总酸呈极显著正相关(P<0.01),与粗蛋白、粗脂肪呈极显著负相关(P<0.01)。浊度与水分呈显著负相关(P<0.05);电导率与食盐、氨基酸态氮、总酸呈正相关,与粗蛋白、粗脂肪、水分呈负相关;p H值与食盐呈正相关。
烟曲霉、白念珠菌诱导巨噬细胞自噬流、焦亡的初步研究
研究背景侵袭性真菌感染主要包括侵袭性念珠菌病、侵袭性烟曲霉病等,在免疫缺陷患者中具有高发病率和死亡率,严重危害患者的生命安全。其中,白念珠菌和烟曲霉是侵袭性真菌感染中非常重要的两种真菌病原体。宿主巨噬细胞在抗真菌感染中发挥重要作用,对巨噬细胞的抗真菌免疫机制研究非常重要。自噬是一种保守的细胞应激反应,在抗感染免疫反应中发挥重要作用。真菌感染可以诱导巨噬细胞自噬,有助于胞内真菌清除,从而消除感染。自噬过程包括吞噬泡形成、自噬体形成、自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体、自噬溶酶体降解等4个步骤;自噬流是这些步骤在细胞内连续出现的动态过程,常用来评价细胞自噬是否行使正常功能。目前有研究证实烟曲霉可诱导巨噬细胞自噬,但是关于烟曲霉early antibiotics对巨噬细胞基础自噬流的影响尚无定论。焦亡是一种比较新的程序性死亡方式,近些年来焦亡已成为感染领域的研究热点。既往关于细胞焦亡的研究主要是关注细菌和病毒感染,但越来越多的证据表明,焦亡在真菌感染中也发挥着关键作用。目前尚关于无烟曲霉及白念珠菌诱导巨噬细胞焦亡的直接证据,关于烟曲霉及白念珠菌能否直接诱导巨噬细胞焦亡以及焦亡发生的生物学意义仍不明确。研究目的本研究的主要目的是,探索烟曲霉对小鼠巨噬细胞自噬流的影响;通过体外及体内实验对烟曲霉能否诱导巨噬细胞焦亡进行初步研究,并初步探索巨噬细胞焦亡在烟曲霉系统感染中发挥的作用以及焦亡的发生机制;通过体外实验对白念珠菌诱导小鼠巨噬细胞焦亡进行初步研究。研究方法1.烟曲霉体外刺激小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)不同时间,免疫印迹法(WB)检测自噬关键蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)-Ⅰ型/Ⅱ型的转换及磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)Ser2481的蛋白水平;烟曲霉和溶酶体阻断剂单独或联合体外刺激BMDMs不同时间后,WB检测LC3-Ⅱ蛋白水平。2.烟曲霉体外刺激BMDMs后,活细胞工作站观察细胞焦亡样形态;实时荧光定量PCR(qRTPCR)检测NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白(NLRP3)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)mRNA表达水平;WB检测NLRP3、胱天蛋白酶-1(caspase-1)、Gasdermin D(GSDMD)的表达水平;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-1β、IL-18分泌水平;敲除GSDMD后,检测焦亡指标的变化。3.构建烟曲霉系统感染模型,比较WT小鼠及GSDMD KO小鼠的生存时长、体重变化、脏器菌载量,WB检测WT小鼠各脏器的GSDMD表达水平,WB检测WT小鼠及GSDImidazole ketone erastin纯度MD KO小鼠脾脏巨噬细胞的NLRP3、caspase-1、GSDMD表达水平,ELISA检测WT小鼠血液及脾脏匀浆的IL-1β、IL-18水平。4.分别抑制THP-1巨噬样细胞的NLRP3、caspase-1、树突细胞相关性C型凝集素 1(Dectin-1)、膜结合 Toll 样受体(TLR)2、TLR4、核转录因子 kappaB(NF-κB)、胞外信号调节激酶(ERK 1/2),再行烟曲霉体外刺激THP-1巨噬样细胞,通过WB检测GSDMD表达水平。5.白念珠菌体外刺激BMDMs后,活细胞工作站观察细胞焦亡样形态,qRT PCR检测 NLRP3、IL-1β、IL-18 mRNA 表达水平,WB 检测 NLRP3、caspase-1、GSDMD的表达水平,ELISA检测IL-1β、IL-18分泌水平,流式细胞术比较WT及GSDMD KO BMDMs对白念珠菌的吞噬率,流式细胞术及LDH释放法分别比较WT及GSDMD KO BMDMs的死亡率,IL-1β预处理BMDMs后再行白念珠菌刺激,观测BMDMs死亡率是否较单纯白念珠菌感染组下降。研究结果1.烟曲霉体外刺激可引起小鼠巨噬细胞LC3-Ⅱ表达水平随时间逐渐升高,各溶酶体阻断剂处理后可使LC3-Ⅱ水平进一步升高。2.体外实验证明烟曲霉感染巨噬细胞后,巨噬细胞可以出现焦亡特征性表现,而敲除GSDMD后,无法诱导焦亡发生。3.在体实验中,小鼠系统感染烟曲霉后,与GSDMD KO小鼠相比,WT小鼠存活率更高、脏器菌载量更低;WT小鼠多个脏器均发生焦亡;WT小鼠脾脏巨噬细胞发生炎症小体活化及焦亡,而GSDMD敲除小鼠未发生上述变化。4.分别抑制 NLRP3、caspase-1、Dectin-1、TLR2、TLR4、NF-κB、ERK 1/2 后,再行烟曲霉体外刺激THP-1巨噬样细胞,发现焦亡被抑制。5.白念珠菌体外刺激可引起小鼠巨噬细胞焦亡,而敲除GSDMD后,无法诱导焦亡发生;与WT组相比,GSDMD KO组巨噬细胞对白念珠菌的吞噬率更低,死亡率更高;IL-1β预处理巨噬细胞后再行白念珠菌刺激,可使巨噬细胞死亡率降低。研究结论1.烟曲霉体外刺激可增加小鼠巨噬细胞基础自噬流。2.烟曲霉可以诱导巨噬细胞发生焦亡,敲除GSDMD后,无法诱导焦亡发生;烟曲霉系统感染可以诱导小鼠焦亡发生,且焦亡可能发挥了抗感染保护作用。3.NLRP3-caspase-1-GSDMD是烟曲霉诱导巨噬细胞焦亡的炎症小体通路,烟曲霉诱导巨噬细胞焦亡可能通过Dectin-1/TLR2/TLR4受体激活巨噬细胞,并传递信号,激活其下游NF-κB通路、ERK 1/2丝分裂原活化蛋白激酶(VX-765MAPK)通路蛋白,从而激活焦亡。4.白念珠菌可诱导巨噬细胞发生焦亡;焦亡的发生可促进IL-1β释放,并通过提高巨噬细胞的免疫活性,降低巨噬细胞死亡率。
经肉桂酸修饰的新型萘普生衍生物的设计、合成及抗炎作用研究
过度的炎症给患者带来痛苦,严重可致亡。萘普生作为一种非甾体抗炎药,可有效缓解过度的炎症反应,但长期服用会导致诸多不良反应的发生。为adoptive immunotherapy了得到抗炎活性优良且毒副作用更小的新型抗炎药物,受肉桂酸生物活性多样性和安全低毒性的启发,本文以S-(+)-萘普生为基本骨架,利用肉桂酸及其类似物对其进行结构修饰,并通过体外生物活性测试和作用机制研究,以期得到高效低CX-5461毒的新型抗炎药物。利用肉桂酸及其类似物,通过Steglich酯化反应,对S-(+)-萘普生这一基本骨架进行结构修饰,合成得到三个系列共88个新型化合物,并对其物理性质和化学结构进行表征,以确证化合物的纯度和结构。然后,建立LPS诱导RAW 264.7细胞体外炎症模型,并利用该模型对给药浓度为50μM的新型化合物进行抑制NO释放活性初筛和IC_(50)测试。与此同时,利用MTT法对化合物进行RAW 264.7细胞毒性测试。接着,从每个系列中分别选取一个活性最好且Z-VAD-FMK研究购买毒性较小的化合物,通过Western Blotting实验研究其抗炎机理。最后,通过分子对接软件Sybyl-X 2.0模拟其与炎症因子的结合情况。经表征,确证了88个新型化合物的化学结构,且纯度较高。经体外抗炎实验和细胞毒性测试,筛选出十个高效低毒的抗炎活性小分子(化合物10、23、26、28、53、58、68、73、86和87)。抗炎机理研究表明,在每个系列中抑制NO释放活性最好的化合物23、53和68对NF-κB通路具有一定的阻断作用,并抑制了NLRP3炎症小体和i NOS、COX-2和IL-1β三种炎症因子的过度表达。分子对接结果表明,该三个化合物均可嵌入该三种炎症因子的活性口袋,与每种炎症因子产生一定的相互作用力。本文合成的新型化合物23、53和68具有高效低毒的特点,可有效阻断NF-κB信号通路,以及抑制NLRP3炎症小体和i NOS、COX-2和IL-1β三种炎症因子的过度表达,从而抑制NO的释放。本文通过天然活性小分子修饰抗炎药物的合成策略有望为新型抗炎药物的研发提供新思路。
胆囊胆固醇结石与SR-B1单核苷酸多态性及环境因素的关联性研究
目的:通过临床病例对照研究的方法,探究SR-B1基因(rs5888和rs838880)在胆囊胆固醇结石患者中的表达及遗传多态性,分析胆囊胆固醇结石患者SR-B1基因的基因位点与血脂指标及性别、民族、环境因素等是否存在差异和关联性进行研究。方法:随机选取我科入院行择期腹腔镜胆囊切除术患者共200例,按照入组标准将胆囊胆固醇结石组(100例)作为病例组;非胆囊结石组(100例)作为对照组,提取所有受试者外周静脉血DNA,应用直接测序法对病例组及对照组试受者的SR-B1基因(rs5888、rs838880)进行SNP分型检测,比较俩组中SR-B1基因(rs5888、rs838880)基因型频率及等位基因频率的差异,探究俩组之间是否存在关联,同时分析胆囊胆固醇结石患者SR-B1基因的基因位点与血脂指标及性别、民族、环境因素的关联性。结果:1.病例组中血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TCH)、低密度脂蛋白(LDL)、载脂蛋白B(Apo-B)水平显著高于对照组;高密度脂蛋白(HDL)、载脂蛋白AI(Apo-AI)水平显著低于对照组(P<0.05)。2.SR-B1基因rs5888位点的等位基因频率、基因型频率在病例组和对照组中的分布差异有统计学意义(P<0.05);两组中等位基因C和T的频率分布差异有统计学意义(P<0.05)。病例组内SR-B1基因rs5888位点的CC基因型者明显高于CT+TT基因型(P<0.05),表明突变基因型CC可能是胆囊胆固醇结石的危险因素(OR=2.279)。C等位基因频率高于T等位基因,表明C等位基因可能增加了胆囊胆固醇结石的患病风险(OR=1.898),病例组中TT型基因者基因频率明显低于对照组,TT型基因者HDL-C明显高于CC和CT型,而TG、TCH含量则较CC和CT型明显偏低(P<0.05),LDL、Apo-AI、Apo-B和Apo-AI/Apo-B差异无统计学意义(P>0.05)。3.SR-B1基因rs838880的等位基因频率、基因型频率在病例组和对照组中的分布差异有统计学意义(P<0.05)。病例组SR-BMCC950细胞培养1基因rs838880位点的CC型者显著少于对照组,这表明SR-Medicago lupulinaB1基因rs838880位点的基因型CC是保护基因型。病例组中TT基因型者的TCH明显高于TC、CC型,差异有统计学意义(P<0.05)。该组中CC型基因者HDL明显高于TC、TT型,差异有统计学意义(P<0.05)。这表明C等位基因可能与血中的HDL-C的升高有关。TG、LDL、Apo-AI和Apo-B差异无统计学意义(P>0.05)。4.有胆囊胆固醇家族病史(OR=63.623)、喜食甜品(OR=40.405)是胆囊胆固醇结石发生的危险因素(均P<0.05);有饮茶习惯(OR=0.000)、有运动习惯(OR=0.001)、有饮食早餐习惯(OR=0.001)是胆囊胆固醇结石发生的保护性因素(P<0.05)。5.基因型(SR-B1基因rs5888)为CC型的患者有胆囊胆固醇结石家族史比无胆囊胆固醇结石家族史更容易患胆囊胆固醇结石(OR=1.335)。有饮茶习惯且基因型(S R-B1基因rs5888)为CC型的患者较无饮茶习惯且基因型为(SR-B1基因rs5888)CC型患病风险降低了84.7%(OR=0.153)。基因型(SR-B1基因rs5888)为CC型的患者有饮食早餐习惯较无饮食早餐习惯者患病风险降低了49.6%(OR=0.504)(均P<0.05)。基因型(SR-B1基因rs838880)为CC型的患者有饮茶习惯比无饮茶习惯更容易患胆囊胆固醇结石(OR=9.765)。有运动习惯且基因型(SR-B1基因rs838880)为CC型的患者较无运动习惯且基因型(SR-B1基因rCaspase抑制剂s838880)为CC型患病风险更高(OR=48.000)。基因型(SR-B1基因rs838880)为TC和TT型的患者喜食甜品较不喜食甜品者患病风险提高了30.0%(OR=1.300)。对于基因型(SR-B1基因rs838880)为TC和TT型的患者,有饮食早餐习惯者较无饮食早餐习惯者患病风险降低了21.4%(OR=0.786),(均P<0.05)。结论:1.SR-B1基因rs5888的基因型CC型可能是胆囊胆固醇结石发生的危险基因型。2.SR-B1基因rs838880的基因型CC型可能为胆囊胆固醇结石的保护基因型,C等位基因可能与血中HDL-C的升高有关。3.SR-B1基因的单核苷酸多态性与血脂及脂蛋白代谢异常有明显相关性。4.胆囊胆固醇结石患者存在不同程度的血脂及脂蛋白代谢异常。5.有胆囊胆固醇结石家族病史、喜食甜品是胆囊胆固醇结石发生的危险因素;有饮茶习惯、有运动习惯及有饮食早餐习惯是胆囊胆固醇结石发生的保护因素。6.基因因素与环境因素的交互作用促进了胆囊胆固醇结石的发生。
胆囊胆固醇结石与SR-B1单核苷酸多态性及环境因素的关联性研究
目的:通过临床病例对照研究的方法,探究SR-B1基因(rs5888和rs838880)在胆囊胆固醇结石患者中的表达及遗传多态性,分析胆囊胆固醇结石患者SR-B1基因的基因位点与血脂指标及性别、民族、环境因素等是否存在差异和关联性进行研究。方法:随机选取我科入院行择期腹腔镜胆囊切除术患者共200例,按照入组标准将胆囊胆固醇结石组(100例)作为病例组;非胆囊结石组(100例)作为对照组,提取所有受试者外周静脉血DNA,应用直接测序法对病例组及对照组试受者的SR-B1基因(rs5888、rs838880)进行SNP分型检测,比较俩组中SR-B1基因(rs5888、rs838880)基因型频率及等位基因频率的差异,探究俩组之间是否存在关联,同时分析胆囊胆固醇结石患者SR-B1基因的基因位点与血脂指标及性别、民族、环境因素的关联性。结果:1.病例组中血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TCH)、低密度脂蛋白(LDL)、载脂蛋白B(Apo-B)水平显著高于对照组;高密度脂蛋白(HDL)、载脂蛋白AI(Apo-AI)水平显著低于对照组(P<0.05)。2.SR-B1基因rs5888位点的等位基因频率、基因型频率在病例组和对照组中的分布差异有统计学意义(P<0.05);两组中等位基因C和T的频率分布差异有统计学意义(P<0.05)。病例组内SR-B1基因rs5888位点的CC基因型者明显高于CT+TT基因型(P<0.05),表明突变基因型CC可能是胆囊胆固醇结石的危险因素(OR=2.279)。C等位基因频率高于T等位基因,表明C等位基因可能增加了胆囊胆固醇结石的患病风险(OR=1.898),病例组中TT型基因者基因频率明显低于对照组,TT型基因者HDL-C明显高于CC和CT型,而TG、TCH含量则较CC和CT型明显偏低(P<0.05),LDL、Apo-AI、Apo-B和Apo-AI/Apo-B差异无统计学意义(P>0.05)。3.SR-B1基因rs838880的等位基因频率、基因型频率在病例组和对照组中的分布差异有统计学意义(P<0.05)。病例组SR-BMCC950细胞培养1基因rs838880位点的CC型者显著少于对照组,这表明SR-Medicago lupulinaB1基因rs838880位点的基因型CC是保护基因型。病例组中TT基因型者的TCH明显高于TC、CC型,差异有统计学意义(P<0.05)。该组中CC型基因者HDL明显高于TC、TT型,差异有统计学意义(P<0.05)。这表明C等位基因可能与血中的HDL-C的升高有关。TG、LDL、Apo-AI和Apo-B差异无统计学意义(P>0.05)。4.有胆囊胆固醇家族病史(OR=63.623)、喜食甜品(OR=40.405)是胆囊胆固醇结石发生的危险因素(均P<0.05);有饮茶习惯(OR=0.000)、有运动习惯(OR=0.001)、有饮食早餐习惯(OR=0.001)是胆囊胆固醇结石发生的保护性因素(P<0.05)。5.基因型(SR-B1基因rs5888)为CC型的患者有胆囊胆固醇结石家族史比无胆囊胆固醇结石家族史更容易患胆囊胆固醇结石(OR=1.335)。有饮茶习惯且基因型(S R-B1基因rs5888)为CC型的患者较无饮茶习惯且基因型为(SR-B1基因rs5888)CC型患病风险降低了84.7%(OR=0.153)。基因型(SR-B1基因rs5888)为CC型的患者有饮食早餐习惯较无饮食早餐习惯者患病风险降低了49.6%(OR=0.504)(均P<0.05)。基因型(SR-B1基因rs838880)为CC型的患者有饮茶习惯比无饮茶习惯更容易患胆囊胆固醇结石(OR=9.765)。有运动习惯且基因型(SR-B1基因rs838880)为CC型的患者较无运动习惯且基因型(SR-B1基因rCaspase抑制剂s838880)为CC型患病风险更高(OR=48.000)。基因型(SR-B1基因rs838880)为TC和TT型的患者喜食甜品较不喜食甜品者患病风险提高了30.0%(OR=1.300)。对于基因型(SR-B1基因rs838880)为TC和TT型的患者,有饮食早餐习惯者较无饮食早餐习惯者患病风险降低了21.4%(OR=0.786),(均P<0.05)。结论:1.SR-B1基因rs5888的基因型CC型可能是胆囊胆固醇结石发生的危险基因型。2.SR-B1基因rs838880的基因型CC型可能为胆囊胆固醇结石的保护基因型,C等位基因可能与血中HDL-C的升高有关。3.SR-B1基因的单核苷酸多态性与血脂及脂蛋白代谢异常有明显相关性。4.胆囊胆固醇结石患者存在不同程度的血脂及脂蛋白代谢异常。5.有胆囊胆固醇结石家族病史、喜食甜品是胆囊胆固醇结石发生的危险因素;有饮茶习惯、有运动习惯及有饮食早餐习惯是胆囊胆固醇结石发生的保护因素。6.基因因素与环境因素的交互作用促进了胆囊胆固醇结石的发生。
酶激活有机荧光探针的构建及其在肝脏疾病诊断中的应用
大多数疾病的发生都会伴随着某些生物活性分子的异常表达,因此众多具有标志性的生物活性分子在疾病的诊断和治疗过程中发挥着极其重要的作用。随着人们对超高灵敏度、实时成像检测需JQ1求的增长,具有高选择性、良好生物相容性、反应迅速、操作简便、灵敏度高、无创等优势的荧光探针,在疾病早期诊断和治疗以及生物体实时成像中显示出巨大的潜力。本文构建了两种新型小分子荧光探针,能够在对生物系统产生最小不良影响的情况下实现对某些生物活性分子的高灵敏度和高选择性检测。具体研究内容如下:(Vorinostat1)γ-谷氨酰转移酶(GGT)广泛存在于活细胞中,并在许多肿瘤组织中过表达。因此,它通常被认为是检测肿瘤,特别是肝癌的重要生物标志物。准确测定其活性有助于相关疾病的早期诊断和治疗。本工作以丹磺酰胺为荧光团,设计合成了一种基于谷氨酰胺键的“开启”型荧光探针NSA-GGT用于检测GGT活性。该探针具有良好的水溶性,能很好地分散在水溶液中。在磷酸盐缓冲液中与GGT孵育后,探针NSA-GGT在～523 nm处的荧光增加了25倍以上。这种传感模式对GGT活性检测显示出较好的灵敏度,并且在细胞内GGT荧光成像方面有良好的表现。后续的生物学实验表明,探针NSA-GGT还可用于活细胞和动物组织中GGT活性的荧光Biosafety protection成像。(2)黑色素瘤原发于表皮和真皮交界处,多出现于皮肤、眼部等部位,其恶性程度高、易转移,肝、肺、骨、腹膜后为转移多发部位。肝脏黑色素瘤是一种极难诊断、致死率极高的恶性肿瘤,目前并没有一种系统性的诊疗标准,基于此我们首次开发了一种基于酶级联反应检测生物体内BChE与TYR活性的近红外小分子荧光探针MB-BChE-TYR,用于肝脏黑色素瘤的早期诊断和术后评估。选用亚甲基蓝(Methylene blue)作为近红外荧光基团,引入对羟基苯乙胺与环丙基甲酸酯,分别作为酪氨酸酶(TYR)与丁酰胆碱酯酶(BChE)的特异性反应位点。而当TYR与BChE存在时,BChE催化酯键断裂,释放出MB-TYR,再经TYR的氧化成为醌,然后经历快速分子内环化导致脲键的自发水解,近红外荧光被激活。实验证实,探针MB-BChE-TYR可以通过荧光强度的变化实现对BChE与TYR的检测,进而实现对肝脏黑色素瘤的监测,有望成为肝脏黑色素瘤的早期诊断与术后评估的辅助治疗手段,提高患者的生存率。
羊踯躅叶抗类风湿性关节炎活性成分的筛选与鉴定
类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)为一种无明确病因的对称性、慢性、自身免疫性炎症疾病,主要侵害人体四肢关节,导致关节处明显可见的红肿、僵直,甚至关节严重畸形,功能完全丧失,给患者带来了巨大的痛苦和精神折磨。一线治疗药物如非甾体抗炎药和皮质类固醇能够快速见效、短期效果好,但长期使用会带来不可承受的毒副作用。寻找更有效安全的药物显得格外重要。许多传统中药材因具有多靶点、毒副作用小、药用历史悠久等特点而被用于治疗类风湿性关节炎关节炎疾病,为治疗RA积累了巨大的药用样本和药用经验。羊踯躅(Rhododendron molle G.Don),一种广泛分布于中国南方地区的落叶灌木木本植物,其果实、根、花均可入药,具有麻醉镇痛、祛风除湿、散瘀杀虫等功效,在中医上具有治疗RA的悠久历史。现代药理学表明,它的果实、根、花都已具有良好的抗炎、抗RA活性。但对羊踯躅叶抗RA的研究十分有限,严重限制了羊踯躅的开发利用。本研究接着课题组的前期工作,围绕羊踯RAD001半抑制浓度躅叶替代传统药用部位治疗RA的潜力以及羊踯躅抗RA活性成分的筛选和鉴定展开实验。具体结果如下:通过细胞毒性实验探究羊踯躅不同药用部位的毒性作用,并确定后续实验的浓度范围。结果显示,高浓度(≥150μg/mL)时,羊踯躅叶的毒性作用比花和果实的高。但浓度为100μg/mL时,其对RAW 264.7细胞的毒性与花和果实的相比,差异不明显。在GC-MS分析中,在羊踯躅叶中共检测到了834种化合物。其中萜类化合物最多,有224种,酮类化合物有72种。羊踯躅各药用部位化合物的种类和数量差别不大,但化合物含量占比不同。高效液相色谱显示,羊踯躅叶、花和果实的洗脱组分大致相同,说明它们的成分差异不大。从毒性和组分差异的角度来看,羊踯躅叶具有替代花和果实作为筛选抗RA活性成分的潜力。前期的细胞实验和动物实验验证了羊踯躅叶的甲醇总提取物对细胞炎症模型具有很强的抗炎活性,而且能显著抑制佐剂性关节炎大鼠的爪关节肿胀、降低关节炎指数。细胞毒性实验显示,目标Biotin cadaverine组分对细胞没有明显的毒性作用。使用脂多糖刺激RWA 264.7细胞构建炎症模型。实时荧光定量结果显示,当目标组分浓度KPT-330使用方法为100μg/m L时,炎症相关基因(TNF-α、IL-6、IL-1β和COX-2)表达水平分别降低了63.82%,80.44%,71.22%,80.46%,NO的生成量则降低了78.93%,表现出了良好的抗炎活性。通过UHPLC-Q-TOF-MS分析,初步鉴定了目标化合物中含有11种黄酮类化合物和18种萜类化合物。接着,对目标组分进行分离纯化,从中分离出了4个单体化合物。通过核磁质谱分析鉴定出了2个化合物的结构,分别是槲皮苷和槲皮素3’-O-葡萄糖,都属于黄酮类化合物,与UHPLC-Q-TOFMS分析结果相一致。分子对接实验显示,槲皮苷与人源炎症蛋白(TNF-α、IL-6、IL-1β、COX-2和NF-κB)具有较强的相互作用,特别是与IL-1β,这可能是其抗炎活性的重要基础。本研究结果表明羊踯躅叶具有替代花和果实作为治疗RA药用部位的潜力,羊踯躅叶中的黄酮类化合物是潜在的抗RA活性成分,为后续羊踯躅叶的临床应用和药物开发提供了实验支持。