PI3K抑制剂

氨基糖苷类抗生素(Aminoglycoside antibiotics,AAs)分子结构是氨基糖与氨基环醇通过氧桥连接而成的苷类化合物,包括卡那霉素、新霉素、庆大霉素等。因其成本低、高效、广谱等特点,在奶牛养殖中应用较常见。通常采用多种AAs协同治疗奶牛的乳腺炎等疾病,因而一种牛奶中检测出多种抗生素超标现象时有发生,严重影响食用者的身体健康。为保障公共健康,避免滥用药物,及时准确地检测出牛奶中的抗生素残留是保障食品安全的重要环节。若单一检测,样本量大,复杂耗时,建立针对同一类抗生素的同步检测方法,可以减少样本量,实现样品的快速高效检测。基于适配体的传感分析方法成为AAs同步检测的重要手段,而适配体传感器多残留检测方法的突破有赖于获得抗生素广谱适配体,其特性决定着分析检测的灵敏度和准确性。因此,本论文具体研究内容及其结果如下:以卡那霉素、新霉素和庆大霉素为混合靶标,采用非固定化氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)-SELEX方法筛选AAs广谱适配体。筛选过程中靶标处于游离状态,GO能够通过π-VE-822π共轭作用吸附未与靶标结合的ssDNA。经过12轮的筛选,然后克隆测序、序列分析和亲和力测定,得到最佳的适配体初步序列AAs 03,对新霉素、庆大霉素和卡那霉素的解离常数(Dissociation constant,Kd)分别为219.69 nM、244.86 nM和312.46 nM。进一步分析了适配体AAs 03的广谱性和特异性,发现适配体AAs 03可识别链霉素、妥布霉素等AAs,Kd值为285.57～322.47 nM,具有良好的广谱性,而对四环素、氯霉素等其他类抗生素结合能力明显弱于AAs,具有良好的特异性。由于适配体AAs 03含有79个碱基,碱基序列过长易形成空间位阻。基于适配体二级结构对其进行剪切优化,获得含有49个碱基的适配体截短序列AAs 03-2,Kd值为94.44～185.94 nM,与原始序列AAs 03相比,Kd值降低1倍,亲和力提高。进一步探讨适配体与抗生素的结合机理,圆二色谱结果表明适配体AAs 03-2与抗生素结合后,适配体的碱基堆积作用减少,其发生构象变化。通过分子模拟软件进行适配体建模和分子对接,发现适配体AAs 03-2碱基位点TGCTAT结合区域形成结合口袋,将AAs包裹起来,在AAs的共有结构脱氧链霉胺与适配体之间的氢键、静电盐桥以及范德华力作用下,以空间结构互补的方式,使二者形成稳定的复合物。为验证筛选的广谱适配体AAs 03-2的应用性能,将其作为识别元件,构建了基于有序介孔碳(Ordered mesoporous carboAZD2281n,OMC)@Ti_3C_2 MXene 纳米材料的新型电化学传感器。OMC能够嵌入到Ti_3C_2 MXene纳米片中,防止Ti_3C_2 MXene堆叠,产生良好的电流通道,增强电极的导电性。OMC@Ti_3C_2 MXene具有较大的比表面积,能够很好的作为纳米载体warm autoimmune hemolytic anemia,容纳大量的适配体以识别和捕获靶标。在AAs存在的情况下,适配体与AAs结合形成复合物,阻碍了电极表面的电子转移,导致电化学信号下降,通过电化学信号的变化定量检测AAs。在最佳的检测条件下,适配体传感器的线性检测范围为10～2,000 nM,检测限(Limit of detection,LOD)为3.51 nM。同时,该适配体传感器具有良好的特异性、稳定性和重现性,能够用于检测AAs。为进一步提高传感器的检测灵敏度,以筛选的广谱适配体AAs 03-2作为识别元件,采用酶辅助循环放大技术构建双模式适配体传感器检测AAs。采用OMC@Ti_3C_2MXene作为基底材料修饰在电极表面,将Au-Pd@Fc纳米材料与信号DNA偶联制备信号探针。当AAs存在时,适配体AAs 03-2与其结合,在核酸外切酶Ⅲ作用下,发生靶标诱导的循环扩增反应,使电极表面信号探针增多,促进电子转移,增强电信号,根据电信号的变化定量检测AAs,检测限为0.0355 nM。同时,信号探针上的Au-Pd@Fc纳米材料具有纳米酶的特性,能够催化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺显色反应,随着AAs浓度的变化,溶液颜色发生变化,通过测定溶液吸光度定量检测AAs,LOD为0.0458nM。适配体传感器在电化学和比色双模式下检测溶液中的AAs,检测结果相互验证,提高了检测方法的准确性。将构建的适配体传感器用于检测牛奶样品中的AAs,牛奶中蛋白质、脂肪、乳糖、Na+、Ca2+主要成分对传感器的电化学信号以及适配体与靶标的结合均造成干扰。制备了能够特异性吸附AAs的磁性分子印迹聚合物(Magneticmolecular imprinted polymers,MMIPs)材料,比较了乙腈萃取结合MMIPs磁吸附分离和乙酸处理结合MMIPs磁吸附分离2种牛奶样品处理方法,发现乙腈结合磁分离的方法对牛奶样品处理效果较好。采用此方法处理样品,并分别通过第4章和第5章构建的电化学适配体传感器对AAs进行检测,LOD分别为3.45～3.97ng/mL和0.0439～0.0574 ng/mL,加标回收试验的回收率分别为96.20%～98.21%和97.19%～98.70%,表明乙腈结合磁分离的方法处理牛奶样品是可行的,并且所构建的适配体传感器能够用于同步检测牛奶中的AAs含量。本研究为适配体应用于抗生素等食品危害物的同步检测提供了理论基础。

第一部分2型糖尿病患者肌肉含量与体内GLP-1水平的关系目的:肌肉减少加重2型糖尿病患者的糖代谢紊乱,GLP-1类似物是目前应用的新型降糖药物,它除降糖作用外具有多器官多靶点保护效应,那么是否对于肌肉减少有影响,本实验探讨了2型糖尿病患者GLP-1水平与骨骼肌含量的关系。方法:回顾选取2020年3月至2021年2月我院住院的非肥胖男性2型糖Paramedian approach尿病患者51例,年龄(59.86±8.41),收集受试者糖尿病病史,测量所有受试者血压、身高、体重并计算体重指数(BMI),空腹8 h后于次日晨起抽取静脉血用于检测空腹血糖(FBG)、血脂水平(TC、TG、HDL-c、LDL-c)及糖化血红蛋白(Hb A1c),应用ELISA法测定GLP-1和DPP-4水平。采用双能X线骨密度仪(DXA)测量所有受试者的骨骼肌含量从而计算骨骼肌指数(SMI),以SMI做分组,A组(n=25,SMI<7 kg/m2)、B组(n=26,SMI≥7 kg/m2)。结果:1.A组和B组两组之间在病程、年龄、空腹血糖、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和DPP4的水平,差异没有统计学意义(P>0.05),A组GLP-1水平显著低于B组[(0.3(0.22)vs(0.5(0.20)ng/ml,P<0.01]。2.单因素分析显示SMI与GLP-1呈正相关(r=0.526,P<0.05)。3.多元线性回归分析显示年龄(β=-0.299,95%CI:-0.054～-0.009,P=0.015)与SMI负相关,而GLP-1(β=0.435,95%CI:0.18～1.612,P=0.001)与SMI正相关。4.二元Logistic回归分析显示以SMI为自变量,以年龄、病程、空腹血糖、糖化血红蛋白、GLP-1水平为因变量,GLP-1水平在P_(50th)以下发生低SMI的风险是P_(50th)以上的10.55倍(95%CI:2.894-38.504,P=0.001)。结论:GLP-1水平在2型糖尿病合并低SMI患者体内是下降的。2型糖尿病中SMI与GLP-1水平独立正相关,随GLP-1水平下降,低SMI的风险明显增加。第二部分GLP-1受体激动剂缓解2型糖尿病小鼠肌肉减少的机制研究目的:探讨GLP-1受体激动剂利拉鲁肽通过直接抑制MAFbx和Mu RF1的表达缓解糖尿病小鼠肌肉减少。方法:1.细胞部分1)以不同浓度利拉鲁肽(100n M,200n M,500n M)对体外培养的C2C12细胞进行刺激,48小时后应用MTT法进行细胞活性检测。2)按照分组将细胞加入药物:对照组(未处理组)、阴性对照组(甘露醇25mmol/L)、高糖组(葡萄糖25mmol/L)、高糖+利拉鲁肽组(葡萄糖25mmol/L+利拉鲁肽200nmol/L),应用Western blot对骨骼肌特异性泛素蛋白酶E3(MMC3供应商AFbx和Mu RF1)和AMPKα蛋白表达水平进行测定。采用ELISA法对3-MH进行检测。2.动物部分将KK-Ay小鼠分为两组,利拉鲁肽治疗组(250ug/kg/d)和等量生理盐水治疗组,每3天记录进食量情况,干预8周。应用骨密度仪测量其脂肪(Fat)和骨骼肌含量(SMM)。在处死小鼠前对小鼠进行眼球取血,应用葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖浓度,断颈处死后快速解剖留取四肢的骨骼肌组织,PBS缓冲液冲洗,吸干表面残留液体,电子天平称重,得到湿重。提取骨骼肌RNA及蛋白质,应用Real-time RT-PCR和Western blot对小鼠骨骼肌MAFbx和Mu RF1的m RNA和蛋白水平进行检测。结果:1.高糖组较甘露醇组和对照组的AMPKα水平明显下降(P<0.01),利拉鲁肽-200干预后AMPKα水平明显升高(P<0.05)。2.高糖组MAFbx和Mu RF1水平明显高于空白对照组和甘露醇组(P<0.01),利拉鲁肽-200干预后MAFbx和Mu RF1水平明显较高糖组降低(P<0.01)。3.甘露醇组和空白对照组3-MH水平无差别,高糖组3-MH水平明显高于空白对照组和甘露醇组(P<0.01),利拉鲁肽-200干预后3-MH水平较高糖组明显降低(P<0.05)。4.KK-Ay小鼠应用利拉鲁肽组较盐水治疗组进食量减少、体重减轻(P<0.01)、血糖下降(P<0.05)。利拉鲁肽治疗组小鼠四肢骨骼肌湿重较生理盐水组有明显升高(P<0.01)。5.利拉鲁肽治疗组的KK-Ay小鼠骨骼肌Mu RF1和MAFbx的m RNA和蛋白表达水平较盐水组明显下降(P<0.05)。结论:高糖环境下AMPKα的表达受抑制,而MAFbx和Mu RF1的m RNA和蛋白水平表达增加,3-MH表达增加即骨骼肌蛋白质分解增加,而利拉鲁肽干预后可缓解这一病理过程。利拉鲁肽能降低糖尿病小鼠的血糖、减轻体重,骨骼肌含量增加,在糖尿病小鼠骨骼肌组织同样可观察到利拉鲁肽对Mu RF1和MAFbx的m RNA和蛋白表达水平有抑制作用。第三部分GLP-1受体激动剂缓解肌肉减少的机制探讨目的:通过地塞米松制造肌肉减少模型,应用GLP-1受体激动剂(利拉鲁肽)干预,观察其缓解肌肉减少的机制。方法:1.将体外培养的C2C12肌细胞用不同浓度利拉鲁肽(10n M,100n M,1000n M)进行刺激,分为空白对照组、利拉鲁肽10 n M组、利拉鲁肽100n M组、利拉鲁肽1000 n M组,对C2C12细胞进行荧光染色,DAPI染色细胞核,以MHC染色评估肌管分化效率。2.将体外培养的C2C12细胞用10u M地塞米松处理制造肌肉减少模型,以不同浓度利拉鲁肽(10n M,1000n M)进行干预,分为空白对照组、地塞米松组、地塞米松+利拉鲁肽10 n M组、地塞米松+利拉鲁肽1000 n M组,仍然进行荧光染色以MHC染色评估肌管分化效率。同时应用Real-time RT-PCR检测MAFbx和Mu RF1 m RNA的表达水平。3.将带有GFP荧光的MAFbx和Mu RF1过表达重组腺病毒进行转染,只表达GFP荧光的腺病毒作为阴性对照,并在MOI为100的条件下转染48 h,MHC染色评价肌管萎缩程度,应用Real-time RT-PCR检测MAFbx和Mu RF1 m RNA的表达水平。结果:1.MHC荧光强度随着利拉鲁肽浓度的增加而增强,利拉鲁肽-1000n M干预组MHC荧光强度最大;Real-time RT-PCR结果显示MAFbx和Mu RF1的m RNA表达水平随利拉鲁肽浓度的增加表达逐渐降低,利拉鲁肽-1000n M干预组下降最显著,差异有统计学意义(P<0.05)。2.地塞米松处理后MHC荧光强度明显下降,应用利拉鲁肽10n M、100n M和1000n M处理后荧光强度逐渐增加,利拉鲁肽-1000n M干预组增加最明显,差异有统计学意义(P<0.05)。3.Ad-GFP组地塞米松处理后MHC荧光强度明显减弱,应用利拉鲁肽1000n M后MHC荧光强度较前增加,差异有统计学意义。Ad-MAFbx和Ad-Mu RF1显著拮抗利拉鲁肽增加MHC荧光强度的作用,差异有统计学意义,(P<0.05)。结论:GLP-1受体激动剂利拉鲁肽以剂量依赖的方式促进成肌细胞分化,并以剂量依赖的selleck HPLC方式抑制MAFbx和Mu RF1 m RNA的转录表达。地塞米松处理组肌管形成显著减少,增加了细胞内MAFbx和Mu RF1的表达水平,利拉鲁肽以剂量依赖的方式降低其诱导的MAFbx和Mu RF1高表达进而改善肌管减少。利拉鲁肽在促进肌肉分化的同时也通过抑制MAFbx和Mu RF1的表达而缓解地塞米松诱导的肌肉减少。

目的 探讨miR-125a对巨噬细胞脂质代谢及主动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）病变的影响及作用机制。方法 油红O及比色法检测巨噬细胞内脂滴情况及脂质含量；生物信息学Mobile social media预测miR-125a下游靶标；双荧光素酶报告基因验证miR-125a与sortilin mRNA靶向结合；qPCR、Western blot和免疫组化检测荷脂THP-1巨噬细胞和低密度脂蛋白受体敲除（LDLR~(-/-)）小鼠中miR-125a及sortilin表达；全自动生化分析仪测定血脂改变；组织染色显示主动脉AS斑块面积及脂质沉积情况。结果 过表达miR-125a可减轻THP-1巨噬细胞内脂质蓄积；生信分析和荧光素酶报告基因显示sortilin mRNA是miR-125a的作用靶标；过表达miR-125a可下调巨噬细胞sortilin表达，减少胞内脂滴数量及脂质含量，改善LDLR~(-/-)小鼠血脂谱selleck HPLC，抑制主动脉脂质沉积及AS病变面积。结论 miR-125a可通过下调sorBelumosudil细胞培养tilin表达抑制巨噬细胞脂质蓄积及主动脉AS病变。

目的 探讨细胞外组蛋白H4对小鼠淋巴细胞Raw264.7细胞凋亡的影响及其与促分裂素原活化蛋白激酶（MAPKs）信号通路的调控关系。方法 收集Raw264.7细胞分为低浓度刺激组、高浓度刺激组及对照组，分别加入50μg/m L、100μg/m L组蛋白H4及不做任何处理，采用FCM法检测各组细胞凋亡率，选取既能诱导细胞凋亡又具有较低细胞毒性的组蛋白刺激浓度进行后续实验。组蛋白H4在去除脂多糖污染后，使用筛选浓度刺激Raw264.7细胞，分别在刺激开始0、5、10、30、60、120 min收取细胞，Western blotting法检测细胞磷酸化ERK(p-ERK)、p-JNK、p-p38蛋白表达。分别使用ERK通路抑制剂、JNK通路抑制剂、p38通路抑制剂、DMSO细胞冻存液预处理Raw264.7细胞1 h，作为ERK抑制组、JNK抑制组、p38抑制组、阴性对照组，另设空白对照组正常培养不做处理，每组分别给予或不给予筛选浓度的组蛋白刺激，采用FCM法检测各组给予或不给予组蛋白刺激的细胞凋亡率。结果 低浓度刺激组、高浓度刺激组细胞凋亡率均高于对照组（P均<0.05），低浓度刺激组、高浓度刺激组细胞凋亡率比较差异无统计学意义，但高浓度刺激组晚期细胞凋亡率及死亡率较低浓度刺激组增高（P均<0.05）。考虑到细胞毒性，选取50μg/m L作为组蛋白H4的刺激浓度。p-ERK蛋白表达在组蛋白刺激10 min及30 min时均高于0 min时，且在30 min时达到高峰，在60 min及120 min时降至初始水平；p-JNK蛋白表达在组蛋白刺激10 miProsthesis associated infectionn及30 min时均高于0 min时，且在10 min时达到高峰，在60 min及120 miAMG510n时降至初始水平（P均<0.05）;p-p38蛋白表达在各时点差异均无统计学意义。空白对照组、阴性对照组组蛋白刺激的Raw264.7细胞凋亡率均高于没有组蛋白刺激的细胞（P均<0.05）,ERK1、JNK及p38抑制组组蛋白刺激、不刺激的细胞凋亡率比较差异均无统计学PF-02341066意义。结论 细胞外组蛋白H4刺激可促进淋巴细胞凋亡，其作用可能通过激活MAPKs信号通路中ERK和JNK信号分子来实现。

目的:比较双相Ⅰ型障碍和双相Ⅱ型障碍患者的人口学特征、临床特征、治疗特征和生理指标。方法:选取符合美国精神障碍诊断与统计手册第5版(DSM-5)双相障碍的患者381例，其中Ⅰ型302例(79.27%),Ⅱ型74例(19.42%),其他特定及相关障碍5例(1.31%)。用自编临床资料访谈表收集人口学资料及临床特征数据。采用多因素logistic回归和多重线性回归分析方法进行因素分析。结果:与双相II型障碍相比，双相I型障碍Panobinostat患者更容易伴有精神病性特征(OR=5.75,next steps in adoptive immunotherapy95%CI:2.82～11.76),病程更长，接受重复经颅磁刺激治疗较多(OR=3.09,95%CI:1.02～9.35),尿酸、总胆固醇、高密度脂蛋白浓度更高，汉族更常见(OR=11.50,95%CI:1.76～75.30)、受教育程度更低(OR=10.22,95%CI:1.16寻找更多～89.77),更少有精神病家族史(OR=2.34,95%CI:1.01～5.42)。结论:双相Ⅰ型障碍和双相Ⅱ型障碍的人口学特征、临床特征、治疗情况和生理指标有差异，可为探讨双相障碍的发病机制提供线索。

目的：探讨盐酸舍曲林联合阿戈美拉汀治疗对抑郁症伴失眠患者睡眠质量的影响。方法：选取2021Laboratory Automation Software年9月至2022年10月淄博市精神卫生中心收治的抑郁症伴失眠患者100例作为研究对象，按照随机数字法分为对www.selleck.cn/products/ABT-263照组和观察组，每组50例。对照组采用盐酸舍曲林治疗，观察组采用盐酸舍曲林联合阿戈美拉汀治疗。比较2组患者临床疗效、睡眠质量、抑郁程度、氧化应激反应及不良反应。结果：观察组的总有效率及SOD水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05);治疗后观察组的睡眠效率、睡眠时间、入睡时间、日间功能、睡眠障碍评分、抑郁程度评分及MAD水平均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05);2组患者的不良反应发生率经比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论：抑郁症伴失眠患者采用盐酸舍曲林联合阿戈美拉汀治疗效果显著，可改善患者的睡眠质量和抑郁GSKJ4程度，调节氧化应激反应，安全可靠，可推广应用。

为了解新疆地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传变异情况，于2020-20LBH58921年从新疆地区规模化猪场采集到326份临床仔猪腹泻病料和肠组织，利用RT-PCR方法对PEDV进行检测，选取部分PEDV阳性样品进行S基因全序列的克隆和测序，并对其序列、遗传进化和抗原表位进行分析。结果显示，326份样品中共有152份样品为PEDV阳性，阳性率为46.6%。选取的11份阳性样品中的PEDV S基因核苷酸(氨基酸)同源性为99.0%～100%(98.2%～99.9%),与GenBank中登录的PEDV参考毒株核苷酸(氨基酸)同源性为92.6%～98.0Polygenetic models%(91.2%～97.7%),与经典株CV777核苷酸(氨基酸)同源性为93.1%～93.4%(92.3%～92.7%)。遗传进化分析显示，11份阳性样品均位于GIIa亚群，与中国疫苗株CV777处于不同的分群，说明新疆部分地区PEDV流行株与疫苗毒株CV777亲缘关系较远。序列比对结果显示，11份阳性样品中的PEDV S蛋白均存在氨基酸的插入和缺失，中和表位的COE区域变异较大，这可能会降低常规疫苗的免疫保护作用。结果表明，从分子水平明确了2获悉更多020-2021年新疆地区PEDV的流行与变异情况，为新疆地区PED的防控提供了科学依据。

番茄(Solanum lycopersicum L.)是茄科番茄属的作物,原产南美洲,是世界广泛栽培的主要蔬菜之一,深受消费者喜爱。番茄果实中的水分占其鲜重的90%以上,水分在一定程度上决定其产量和品质的形成。在番茄生长过程中,为了保持其正常生长发育,植株需要吸收大量水分。随着全球气温的升高,干旱胁迫对植物的影响越来越严重。番茄作为逆境敏感植物,经常会受到干旱胁迫的伤害,严重影响了番茄的生长和发育,制约着番茄产业的发展。组蛋白作为一种重要的表观修饰因子,在植物的生长发育和响应逆境胁迫过程中起着重要作用。组蛋白H2A是核小体的重要组成部分,并且存在H2A.diversity in medical practiceZ等变体形式。目前组蛋白变体H2A.Z在响应逆境胁迫中的研究主要集中在温度响应和盐胁迫,而H2A.Z在干旱响应中的作用鲜有报道。为此,本研究以组蛋白变体H2A.Z的双突变体sl_hta9 hta11为材料,研究并发现H2A.Z在番茄抗干旱胁迫过程中发挥重要的作用,通过转录组测序(mRNA-seq)分析Sl_H2A.Z突变后全基因组水平的基因表达情况及其影响的信号通路,发现过氧化氢(H2O2)和ABA介导的番茄中H2A.Z调控干旱胁迫的生理机制。本研究最终揭示了组蛋白变体H2A.Z调控番茄抗干旱胁迫的分子机制。论文主要研究结果如下:(1)通过对番茄sl_hta9hta1l双突变体干旱胁迫表型观察,发现干旱胁迫的第15天,与WT野生型相比,干旱胁迫导致sl_hta9hta11双突变体叶片黄化萎蔫,叶片的尖端和边缘卷曲严重;干旱胁迫26天后对其复水,发现WT的成活率达到100%,而sl_hta9 hta11双突变体的成活率只有16.7%,表明组蛋白H2A.Z具有较高的抗旱功能。干旱胁迫下sl_hta9 hta11双突变体的叶片相对含水量显著下降,丙二醛和相对电导率的含量显著高于WT野生型,进一步表明H2A.Z在抗旱胁迫过程中的重要作用。(2)为了进一步研究H2A.Z在番茄干旱胁迫应答过程中的调控机制,通过对干旱胁迫10天后的sl_hta9hta11双突变体和WT野生型的叶片进行转录组测序,共鉴定出14896个差异表达的基因,其中上调的有7113个,下调的有7783个,正常条件下,sl_hta9hta11双突变体与WT野生型相比有723个DEGs显著上调,936个DEGs显著下调;干旱胁迫下,与WT野生型相比,sl_hta9hta11双突变体中差异表达的基因数量减少,其中有686个DEGs显著上调和744个DEGs显著下调。通过对DEGs进行KEGG功能分析,我们发现这些基因参与多个生物代谢通路,主要包括光合作用,代谢途径,生物合成,MAPK信号通路和植物激素信号转导等,表明H2A.Z在转录层面上参与了番茄的干旱应答,并调控了多个生物学途径相关的基因的表达。(3)干旱胁迫后,WT野生型抗氧化酶活性均升高,干旱诱导的抗氧化物酶活性升高因H2A.Z的突变而selleck激酶抑制剂被抑制,表明H2A.Z影响番茄的抗氧化系统的活性以应对逆境胁迫产生的活性氧危害。通过检测叶片气孔发现,干旱胁迫后,WT叶片气孔开张率在70%以下,而sl_hta9hta11突变体中叶片气孔开张率在80%以上,表明WT叶片的气孔调节能力比sl_hta9hta11双突变体的调节能力强,以应对干旱胁迫带来的植物体内水分的缺失。内源ABA含量检测表明,在正常条件下植物叶片中的ABA含量受H2A.Z负调控,在干旱胁迫下,sl_hta9 hta11双突变体中ABselleckchem GSI-IXA合成受阻,表明组蛋白变体H2A.Z在番茄干旱胁迫中发挥着重要作用,H2A.Z可能是通过调控ABA生物合成途径响应干旱胁迫。

近年来,大气污染引发的健康问题一直是全世界关注的焦点以及科学研究的热点。其中,超细颗粒物(PM_(0.1),空气动力学直径≤100 nm)可能是导致健康损伤的主要贡献者。现有研究提示了PM_(0.1)暴露与神经系统疾病的相关性。然而,颗粒物的摄入途径及其是否具有神经发育毒性效应尚不明确。小鼠胚胎干细胞(mESCs)具有发育全能性,可以定向诱导分化成神经元,被用于研究各种环境污染物的早期胚胎发育毒性和功能性毒性。为此,本课题拟基于胚胎干细胞阐明超细颗粒物的摄入行为及其对神经发育的影响及相关分子机制。1.考虑到大气环境及其污染物的复杂性,本部分研究选择量子点(QDs)作为模式超细颗粒物探究其在mESCs中的摄入及外排行为。首先,我们通过透射电子显微镜(TEM)、动态光散射、荧光分光光度计和电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)对QDs的形貌、zeta电位、水合粒径、光谱特征及稳定性进行了表征,发现QDs是粒径约为10 nm的球形颗粒,其在水和培养基中均带负电,其最佳发射波长为646 nm,并且在水溶液中不易释放金属离子;通过细胞活力筛查了QDs的亚致死浓度,在此基础上,借助QDs的荧光信号,结合流式细胞仪及荧光成像研究了QDs在mESCs中的摄入、外排过程。结果表明,mESCs对QDs的摄取具有时间和剂量依赖效应,同时QDs会被细胞外排,部分被细胞摄取的QDs存在于细胞内。2.大脑发育是一个复杂且精密调控的过程,定向诱导mESCs神经分化为神经发育领域研究提供了有力依据。为此,本部分研究拟建立mESCs单层神经分化模型探究PM_(0.1)潜在的神经发育毒性。我们首先对PM_(0.1)的形貌、zeta电位及水合粒径进行了表征,发现其为不规则聚集体,它的水合粒径大于TEM粒径,且在水和培养基中均带负电;在亚致死浓度暴露的基础上,发现PM_(0.1)暴露产生氧化应激并影响mESCs自我更新能力;将mESCs定向诱导神经分化后,通过光学显微镜、RT-q PCR技术及Fluo-3 AM荧光探针,考察PM_(0.1)对神经细胞形Immuno-chromatographic test态学、多能性、神经发生关键因子、细胞内Ca~(2+)水平及细胞周期等神经发育的影响。结果表明,PM_(0.1)暴露会影响神CB-839说明书经丝的数量、改变神经元形态,诱导神经发生相关因子Map2、Dcx、Neurod1、Pax6、Snai2、Msx2的表达降低和多能性因子Sox2的表达增加,从而抑制mESCs神经分化。同时,PM_(0.1)暴露增加了细胞内钙离子水平、抑制了细胞增殖,使细胞G1期和S期进程受阻。3.现有研究表明,RNA甲基化在神经发生以及神经发育过程中发挥重要的调控作用。在本部分研究中,我们基于甲基化RNA免疫共沉淀结合高通量测序(MeRIP-seq)探究了PM_(0.1)介导神经分化异INCB018424临床试验常的分子机制。首先,通过RT-q PCR实验检测了PM_(0.1)暴露后N~6-甲基腺嘌呤(m~6A)修饰的甲基化转移酶、去甲基化酶和识别蛋白的m RNA表达量,发现PM_(0.1)诱导甲基转移酶(Mettl3、Mettl14、Wtap)表达升高、去甲基化酶(Fto)表达降低及识别蛋白(Ythdc1、Ythdc2、Ythdf2、Hnrnpa2b1、Eif3a)表达异常。功能富集分析(GO分析)发现发生差异m~6A甲基化修饰的m RNA主要富集在突触组织、轴突生成、树突发育、神经发生调节、前脑发育等神经发育过程。进一步对其进行MeRIP-seq和RNA-seq联合分析,发现PM_(0.1)处理组中的92个m RNA的表达变化可能与m~6A修饰有关。通过Clue GO对这些差异基因进行GO富集分析,发现变化最为明显的团簇为大脑发育过程,经过验证发现PM_(0.1)暴露后可能通过m~6A修饰降低Sall1、Pou4f1、Bcl11b、Zic1、Hoxa2、Nr2e1表达进而影响神经发育过程。综上所述,本研究考察了超细颗粒在mESCs中的摄入、外排行为,通过体外诱导神经分化模型,进一步解析了PM_(0.1)的潜在神经发育毒性机制,实验数据为PM_(0.1)的健康风险评估提供了理论依据。

番茄(Solanum lycopersicum)作为主要ZD1839化学结构的蔬菜作物,生产上受到烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的严重危害。抗病毒基因沉默是由病毒的保守模式分子(Pathogen associated molecular pattern,PAhospital-acquired infectionMP)双链RNA触发的抗病毒反应,也称为PTI(PAMP triggered immunity)。同时植物还有抗病基因识别病毒效应子而触发的ETI(Effector triggered immunity)抗病毒反应,在抗病育种中发挥重要作用。TMV的基因沉默抑制子是病毒的毒力因子同时也是触发ETI反应的效应子。本研究立足于近年来关于植物抗病PTI与ETI相互影响的观点,以番茄以及茄科模式植物本氏烟草和栽培烟草为研究材料,系统性筛选TMV抑制子突变体,为PTI与ETI的相关性研究提供不同毒力的病毒材料,同时为植物抗病毒提供弱毒毒株和防控策略。研究结果如下:(1)TMV突变体的筛选。基于实验室已有的338个TMV-GFP突变体,从病毒复制、抑制子功能、系统性传播和与抗病基因N互作能力四个方面,综合筛选出6个抑制子功能弱突变体(Mild mutant,MM)和6个抑制子功能重度突变体(Severe mutant,SM)。(2)本氏烟草中TMV抑制子功能鉴定体系的建立。原核表达纯化TMVHEL蛋白,并制备小鼠抗体,通过瞬时表达TMV-GFP及突变体,使用抗体血清检测P126表达情况。其次,构建抑制子P126的突变型表达载体,与GFP共表达,通过Western-blot定量检测,筛选出5个MM突变体和4个SM突变体。(3)栽培烟草SR1与番茄A57和M82中病毒侵染体系的建立。将筛选出的突变体SAG分子式分别侵染栽培烟草SR1和SR1中PTI通路关键基因(Rd R1/Rd R6、DCL2/DCL4)RNAi的株系,发现突变体在RNAi株系中系统性传播能力增强。同时,在番茄A57、M82以及M82的DCL2敲除株系中,发现尤其是MM突变体的系统性侵染能力显著恢复。初步在栽培烟草与番茄中成功建立TMV的系统性侵染体系,为后续实验室在两个物种中的抗病机制研究奠定基础。本研究成功筛选出复制、系统性传播和与N基因互作均正常但抑制子功能不同程度突变的TMV突变体,在栽培烟草与番茄中建立了病毒侵染体系,为植物抗病毒的PTI与ETI互作研究提供了参考,为植物抗病育种提供了新思路。