PI3K抑制剂

吡啶、异喹啉和二氢异喹啉是药物化学中常见的化学结构,具有广泛的生物活性,如抗病毒,抗肿瘤等。此外,吡啶及异喹啉衍生物2-芳基乙基吡啶和喹诺里西啶也是药物化学中重要的结构,是许多天然产物和药物的核心骨架。因此,围绕上述重要分子结构发展高效的合成策略及官能化方法具有重要意义。烯丙基化反应是构筑碳-碳键和碳-杂键的重要有机反应,被广泛用于天然产物和生物活性分子等的合成中。自1965年Tsuji等首次报道了钯催化的丙二酸酯与烯丙基化合物(如乙酸烯丙酯和烯丙基溴)的烯丙基化反应以来,过渡金属催化的烯丙基化反应已得到广泛应用。该类反应存在重金属残留、条件苛刻、环境不友好等问题,限制了其在药物合成中的应用。Morita–Baylis–Hillman(MBH)碳酸酯是有机合成中常见的烯丙基化试剂,已被广泛用于活泼亲核试剂的烯丙基化反应。与过渡金属催化的烯丙基化反应相比,该反应无需使用贵金属催化剂,具有原子经济、条件温和、环境友好等优点。然而,MBH碳酸酯参与的非活泼碳亲核试剂如2-烷基吡啶、1-烷基-3,4-二氢异喹啉等Galunisertib的α-C(sp~3)-H烯丙基化反应尚有待研究。鉴于此,本论文希望开发一种无需催化剂参与的2-烷基吡啶或1-烷基-3,4-二氢异喹啉与MBH碳酸酯的烯丙基化方法,用于合成结构多样的吡啶和3,4-二氢异喹啉衍生物。本论文工作主要包括以下三个部分,分别为:无催化剂参与的2-烷基吡啶的烯丙基化反应研究,无催化剂参与的1-烷基-3,4-二氢异喹啉的烯丙基化反应研究,以及它们在2-芳基乙基吡啶及喹诺里西啶衍生物合成中的应用。在第二章中,开发了2-烷基吡啶和MBH碳酸酯之间的无催化剂参与的α-C(sp~3)-H烯丙基化反应。首先,以2-甲基吡啶2-1a和MBH碳酸酯2-2a作为模板底物,探索反应条件。通过筛选反应溶剂和温度,得到了最佳反应条件:以无水乙腈为溶剂,2-甲基吡啶2-1a和MBH碳酸酯2-2a的投料量为2:1,在80℃,N_2保护下反应4h,能以91%产率得到目标产物2-3a。然后在最佳反应条件下,对MBH碳酸酯底物适用范围研究发现Belumosudil采购,苯基取代的MBH碳酸酯苯环上含有吸电子基团时,如-NO_2、-CO_2Me、卤素等,具有良好的耐受性,能以中等至良好的产率(69–78%)得到相应的目标产物;而苯环上含有给电子基团的底物(如-OMe)进行该反应时,反应较为缓慢,且仅能以47%的产率得到相应的目标产物。此外,脂肪族基团取代的MBH碳酸酯也能耐受该反应条件。另外,对2-烷基吡啶的底物适用范围研究发现,吡啶环的3位或5位上含有烷基取代基的底物具有良好的耐受性,能以良好的产率(71–83%)得到目标产物。然而,2,4-二甲基吡啶与MBH碳酸酯反应时,体系较为复杂,形成了多种副产物,仅分离出39%的目标产物。值得注意的是,2-甲基-4-溴吡啶及1-甲基异喹啉也能兼容该反应条件,但该反应需要在更高的反应温度(100℃)下进行。此外,空间位阻较大的底物(如2,6-二甲基吡啶)不耐受该反应条件。在上述反应条件下,本论文合成了21个2-烷基吡啶的α-C(sp~3)-H烯丙基化产物。上述报道的2-烷基吡啶的烯丙基化反应不需要金属或其它催化剂的参与,具有操作简便、底物范围广、环境友好等优点,可用于构建具有结构多样性的吡啶衍生物。在第三章中,开发了1-烷基-3,4-二氢异喹啉和MBH碳酸酯之间的无催化剂参与的α-C(sp~3)-H烯丙基化反应。首先,以1-乙基-3,4-二氢异喹啉3-1a和MBH碳酸酯3-2a作为模板底物,探索反应条件。通过筛选反应溶剂和温度,得到了最佳反应条件:以无水乙腈为溶剂,1-乙基-3,4-二氢异喹啉3-1a和MBH碳酸酯3-2a的投料量为1:1.5,在80℃,N_2保护下反应2h,能以87%的产率得到目标产物3-3aa。然后在最佳反应条件下,对底物的适用范围研究发现,1-烷基-3,4-二氢异喹啉serum biochemical changes底物3-1的R基团被其它脂肪族基团(如~nBu、Bn、苯丙基)取代时,均能耐受该反应条件,并以良好的产率(77–78%)得到相应的目标产物。空间位阻较大的底物(如R=~iPr或环己基),也能顺利进行该反应。而当1-苄基-3,4-二氢异喹啉为底物时,该反应产率(56%)稍低,可能是因为苄基位置容易被氧化。此外,1-烷基-3,4-二氢异喹啉芳香环上含有各种吸电子基团的底物均能以优异的产率(86–93%)得到目标产物,而含有给电子基团(-OMe)的底物产率(64–69%)稍低,这可能是因为带有甲氧基的3,4-二氢异喹啉的亚胺部分具有更高的水解倾向。3,4-二氢异喹啉的苯环被杂环取代时,也能以中等至良好的产率(63–79%)得到相应的产物。在上述反应条件下,本论文合成了25个1-烷基-3,4-二氢异喹啉的α-C(sp~3)-H烯丙基化产物,该反应可用于快速构建结构多样的3,4-二氢异喹啉烯丙基化产物。第四章介绍了上述烯丙基化反应在合成具有重要生物活性的2-芳基乙基吡啶和喹诺里西啶衍生物中的应用。首先,以2-甲基吡啶的烯丙基化产物2-3a作为底物,通过水解反应得到羧酸4-1,然后将羧酸4-1与脂肪胺和芳香胺在不同的偶联条件下反应,得到了17个酰胺衍生物。同时以烯丙基化产物2-3j为底物与α-氯代甲醛肟进行[3+2]环加成反应,得到了12个二氢异噁唑衍生物。然后,本论文对1-烷基-3,4-二氢异喹啉烯丙基化产物3-3进行了衍生化探索。烯丙基化产物3-3有6-exo-trig(内酰胺化)和6-endo-trig(aza-Michael加成反应)两种环化方式,主要受底物3-3上的酯基和还原剂的影响。当以1-烷基-3,4-二氢异喹啉与MBH碳酸酯(EWG=CO_2Me)的烯丙基化产物为底物,以Na BH(Ac O)_3为还原剂,以甲苯为溶剂时,能发生内酰胺化反应,得到4个喹诺里西啶酮衍生物;当以1-烷基-3,4-二氢异喹啉与MBH碳酸酯(EWG=CO_2~tBu)的烯丙基化产物为底物,以Na BH_4为还原剂,以甲醇为溶剂时,则发生分子内aza-Michael加成反应,得到4个喹诺里西啶衍生物。在确定分子内环化的反应条件后,进一步研究发现,1-烷基-3,4-二氢异喹啉与MBH碳酸酯(EWG=CO_2Me)能进行烯丙基化及分子内环化的一锅法反应,简化了实验操作。综上所述,本论文开发了无催化剂参与的2-烷基吡啶或1-烷基-3,4-二氢异喹啉和MBH碳酸酯的α-C(sp~3)-H烯丙基化反应,并研究了其在2-芳基乙基吡啶和喹诺里西啶衍生物合成中的应用。该烯丙基化反应不需要额外添加催化剂,对环境友好,且该反应在合适的溶剂和温度下即可进行,操作简便,底物适用范围广。合成的烯丙基化产物可进一步转化为具有结构多样性的吡啶和喹诺里西啶衍生物。该烯丙基化反应在药物化学中具有潜在的应用价值。

目的:探究低频重复经颅磁刺激(r TMS)作用于右侧背外侧前额叶(r DLPFC)对青少年抑郁症伴非自杀性自伤患者情绪调节的影响,并进一步研究认知情绪调节策略在低频重复经颅磁刺激改善非自杀性自伤中的中介作用,为改善www.selleck.cn/products/torin-1青少年抑郁症伴非自杀性确认细节自伤患者的情绪调节、减少自伤提供临床应用参考。方法:根据纳入及排除标准选取60名青少年抑郁症伴非自杀性自伤患者作为研究对象,并随机分为实验组和对照组。研究采取单盲实验法,实验组在接受盐酸氟西汀药物治疗和一般性心理治疗的基础上,进行为期2周,每周5次的低频r TMS真刺激;对照组在接受盐酸氟西汀药物治疗和一般性心理治疗的基础上,进行为期2周,每周5次的低频r TMS伪刺激。干预前后采用自编的一般人口学资料问卷、抑郁自评量表(SDS)、认知情绪调节问卷(CERQ)、情绪调节困难量表(DERS)、青少年非自杀性自伤行为评定量表(ANSSIQ)对两组被试进行评估。结果:1.干预后,实验组在SDS、PCERQ、NCERQ、DERS以及ANSSIQ量表上的评分与干预前存在显著差异(p<0.001)。2.干预后,实验组在SDS、NCERQ、DERS以及ANSSIQ量表上的评分显著低于对照组,PCERQ评分显著高于对照组(p<0.05)。3.NCERQ的评分变化量作为低频r TMS减少NSSI行为的中介变量的中介效应值为-0.2510,95%CI为(-0.5686,-0.0145),中介效应显著。4.NCERQ的评分变化量作为低频r TMS降低NSSI意图的中介变量的中介效应值为-0.1944,95%CI为(-0.4392,-0.0100),中介效应显著。结论:1.低频r TMS刺激r DLPFC能够protamine nanomedicine有效改善青少年抑郁症伴非自杀性自伤患者的抑郁情绪,提高积极认知情绪调节策略的使用倾向,降低消极认知情绪调节策略的使用倾向,改善情绪调节困难。2.低频r TMS刺激r DLPFC能够有效减少青少年抑郁症伴非自杀性自伤患者的自伤行为,降低自伤意图。3.消极认知情绪调节策略在低频r TMS刺激r DLPFC以减少自伤行为、降低自伤意图中起到中介作用,具体而言,低频r TMS刺激r DLPFC通过降低消极认知情绪调节策略使用倾向以减少自伤行为、降低自伤意图。

目前,临床癌症研究的热点问题是深部肿瘤的诊断和治疗。解决该问题的棘手之处在于开发具有高组织穿透性的肿瘤精确成像和有效治疗手段以及诊疗试剂。最近十几年来,科研人员陆续发现了可用于光声成像(PAI)和光热治疗(PTT)的具有近红外二区(NIR-II)光谱吸收纳米材料,用于核磁共振成像(MRI)的含钆(Gd)、铁(Fe)等元素的纳米材料,可用于计算机断层扫描(CT)与放射疗法(RT)的含有高原子序数的纳米材料和可用于X射线诱导光动力疗法(X-PDT)的掺杂镧系元素的纳米闪烁体。这些技术手段由于光源在生物组织内的高穿透性,在深部肿瘤的成像与治疗中具有巨大的潜力。纳米材料经过表面修饰可具有多模态成像功能和协同治疗功能。本论文旨在探索可用于深部肿瘤成像与治疗的多功能纳米体系,研究新型多功能纳米体系及其在深部肿瘤成像与治疗方面的效果。本文的主要工作如下:(1)为了研究纳米试剂对提高深部肿瘤成像效果的影响,我们设计合成了钕(Nd)、钆(Gd)共掺杂氟化钙纳米闪烁体,并用于NIR-II与MRI多模态成像研究。利用简单的水热合成方法引入柠檬酸钠作封端剂共沉淀制备了Ca F_2/Nd~(3+)(CN)、Ca F_2/Nd~(3+)-Gd~(3+)(CNG)纳米闪烁体,该纳米闪烁体在808 nm激光器激发下发射强1064 nm NIR-II荧光,并且在NIR-II成像系统中表现优良。随后,通过https://www.selleck.cn/products/cb-839.html向CN中引入Gd~(3+)破坏Nd~(3+)-Nd~(3+)团簇结构,增加游离的Nd~(3+)数量,增强NIR-II荧光强度。由于CNG结构中引入了Gd~(3+),故其还具有T1 MRI造影能力,且r1值强于市售MRI造影剂。所以,CNG纳米闪烁体可用作NIR-II及MRI双模态成像,并且CNG-PEG NPs细胞毒性较低,在双模成像系统诊断时不会引起明显的生物毒性。(2)为了研究纳米试剂对提高深部肿瘤治疗效果的影响,我们成功开发了Ca F_2/Eu~(3+)-PTX/VBBO(CEPV)纳米平台用于深部乳腺癌的X-PDT与化疗的协同治疗。CEPV是一种高灵敏度的多功能放射增敏剂,由于光源是X射线,因此可以突破组织深度限制。Ca F_2/Eu~(3+)(CE)可以有效地将X射线转化为可见光,具有强X射线激发荧光光谱(XEOL),光敏剂维多利亚蓝(VBBO)的吸收光谱与之发射荧光波长几乎完全一致,实现了最大的荧光共振能量转移(FRET);选取的化疗药物紫杉醇(PTX)可以作为放射增敏剂,降低X射线使用剂量,增强X-PDT的效果。在X线照射下,CEPV表现出优于Ca F_non-viral infections2/Eu~(3+)-VBBO(CEV)的治疗效果,这些巧妙的设计共同促成了XGW-572016采购-PDT与化疗之间的有效协同作用。所以,CEPV是一种很有前途的深部癌症治疗策略的候选药物。

贵州省是我国第二大烤烟主产区,烤烟是当地烟农的主要经济来源和地方财政的重要支柱。尽管烤烟连作存在弊端,但人多地少、耕地资源有限和烤烟经济收益高于其它夏粮作物等原因,导致烤烟连作与烤烟//玉米轮作仍是当地长期共存的两种主要种植模式。目前,结合不同的烤烟种植制度开展施肥模式的长期研究尚不多见,Cardiac histopathology而氮钾是烤烟的产量品质元素,需肥多,在土壤中活跃,研究不同的烤烟种植制度与施肥模式耦合下的土壤氮钾转化,服务于种植制度中的合理施肥具有重要意义。为此,本项研究依托贵州省遵义市烤烟长期田间定位试验(建于2004年),探究烤烟种植(烤烟连作和烤烟//玉米轮作)和施肥(单施化肥和化肥有机肥配施)模式下,2021和2022年作物的产质量,养分吸收和利用效率,土壤不同形态的氮钾转化,相关生物活性,以及相互关系,解析长期种植施肥对烟地生产力和植烟黄壤氮钾转化的影响,为遵义烟区烤烟科学种植提供理论依据。本试验的主要研究结果如下:(1)长期轮作的烤烟产量和产值分别比长期连作的烤烟增加19.1%～46.9%和21.9%～57.6%,轮作烟叶的氮、钾含量较高,氯和烟碱含量较低,钾氯比例和氮碱比例更协调;与单施化肥相比,长期化肥有机肥配施的烤烟产量和产值分别增加10.7%～33.7%和14.9%～42.9%,其烟叶钾含量较高,且还原糖和蛋白质含量较为适宜,使烟叶的钾氯比例和施木克值也更协调。此外,长期化肥有机肥配施显著提高玉米和绿肥产量。(2)在轮作模式中,玉米的磷素养分吸收量、肥料农学效率、肥料经济学效率和肥料偏生产力均高于连作模式中的烤烟,而烤烟的钾素养分吸收量显著高于玉米;长期化肥有机肥配施处理的钾素养分吸收量、肥料农学效率和肥料偏生产力均显著高于单施化肥处理,分别增加42.1%～45.3%、23.6%～34.5%和13.8%～31.3%。即长期化肥有机肥配施显著提高肥料的经济效益,促进了烤烟和玉米对土壤中养分的吸收利用,提高了烟地生产力。(3)与单施化肥处理相比,长期化肥有机肥配施处理显著提高土壤碱解氮、铵态氮、硝态氮和微生物氮的含量,表明土壤中氮素转化活跃,有利作物吸收利用;并且,长期化肥有机肥配施显著提高土壤蛋白酶、脲酶、硝酸和亚硝酸还原酶等的活性,这些酶活性的提高促进土壤氮素转化,改善土壤氮素供应。Person相关分析表明,土壤有效态氮含量与这4种酶活性均呈极显著的正相关性(r=0.732**～0.961**,n=18,p≤0.01)。与长期连作相比,长期烤烟//玉米轮作显著提高了烟地土壤中的硝态氮含量,有利于改善植烟土壤的氮素供应和轮作烟株的生长发育。(4)与烤烟连作相比,长期烤烟//玉米轮作显著提高了Adezmapimod土壤非交换性钾、交换性钾和水溶性钾的含量,3种钾含量提高的幅度依次是4.7%～8.0%、4.4%～5.8%和7.1%～22.8%;长期化肥有机肥配施的处理比长期单施化肥的处理显著增加上述3种钾的含量,它们增加的幅度分别是6.8%～10.2%、9.7%～11.1%和8.2%～24.2%。(5)土壤不同形态氮、钾养分与烤烟和玉米产质量、养分吸收量和养分利用效率均存在显著性相关性。其中,碱解氮、铵态氮、硝态氮、微生物氮、非交换性钾、交换性钾和水溶性钾均与烟叶产量呈极显著正相关关系,相关系数变幅在0.752**～0.965**(n=18,P≤0.01)。土壤有效态氮与烟叶氮、烟碱、总糖和蛋白质含量呈极显著正相关,相Liproxstatin-1作用关系数变幅在0.656**～0.831**(n=18,P≤0.01)。土壤非交换性钾、交换性钾与烟叶烟碱、钾含量呈极显著正相关,相关系数变幅在0.911**～0.960**(n=18,P≤0.01);与烟叶氯含量呈显著负相关,相关系数为-0.890*(n=18,P≤0.05)。总之,长期烤烟//玉米轮作和化肥有机肥配施显著地提高了烤烟的产量与品质,促进了土壤氮、钾素转化,增加土壤有效态氮和钾的含量,提高了土壤酶活性和微生物生物量。因此,在黔北烟区,烤烟//玉米轮作和化肥有机肥配施有益于烤烟生产的可持续发展,值得推广应用。

目的:研究不同类型原发性青光眼患者房水中IL-36Ra、IL-37、IL-38的表达及其与病情程度的相关性。方法:采用前瞻性病Cell culture media例对照研究,连续选取2021年07月至2022年07月在石家庄市人民医院眼科进行手术治疗并符合纳入标准的原发性青光眼患者71例(71眼)及年龄相关性白内障(Age Related Cataract,A RC)患者25例(25眼)作为研究对象。将受试者分为4组,其中观察组分为原发性急性闭角型青光眼组(Primary acute angle closure glaucoma,APACG)25例(25眼)、原发性慢性闭角型青光眼组(Chronic Primar y Angle Closure Glaucoma,CPACG)23例(23眼)和原发性开角型青光眼组(Primary Open Angle Glaucoma,POAG)23例(23眼),对照组为ARC组。采集4组患者术前房水样本,通过酶联免疫吸附试验法(E nzyme-linked Immunosorbent Ass寻找更多ay,ELISA)分别检测患者房水中白细胞介素36受体拮抗剂(Interleukin-36 Receptor Antagonist,IL-36Ra)、白细胞介素37(Interleukin-37,IL-37)、白细胞介素38(Interleukin-38,IL-38)的含量,采用OCT检测观察组患者术前平均视网膜神经纤维层(R etinal Nerve Fiber Layer,RNFL)厚度。比较各组间IL-36Ra、IL-37、I L-38表达水平的差异,讨论其与原发性青光眼类型的相关性,分析不同类型原发性青光眼患者术前房水中IL-36Ra、IL-37、IL-38表达情况与平均RNFL厚度的相关性。研究数据均使用SPSS 27.0Entinostat半抑制浓度统计软件进行分析,使用Sha-piro-Wilk进行正态性检验,所有数据均符合正态分布,均采用均数±标准差表示,各组间比较采用单因素方差分析,IL-36Ra、IL-37、IL-38含量与平均RNFL厚度的相关性用Pearson相关分析,P<0.05表示差异有统计学意义。结果:1.房水中IL-36Ra含量:CPACG组(5.276±1.183)pg/ml明显高于ARC组(4.088±0.912)pg/ml(P<0.001),而APACG组(3.978±0.832)pg/ml、POAG组(4.378±1.174)pg/ml较ARC组(4.088±0.912)pg/ml差异均无统计学意义(P＞0.05)。各青光眼组间比较:CPAC G组明显高于APACG组(3.978±0.832)pg/ml和POAG组(4.378±1.174)pg/ml(P<0.001,P=0.004);余各组间进行比较,结果显示差异均无统计学意义(P＞0.05)。2.房水中IL-37含量:CPACG组(19.659±3.995)pg/ml、POAG组(19.188±2.885)pg/ml明显高于ARC组(16.293±2.878)pg/ml(P<0.001,P=0.004),而APACG组(15.465±3.500)pg/ml较ARC组(16.293±2.878)pg/ml差异无统计学意义(P＞0.05)。各青光眼组间比较:C PACG组(19.659±3.995)pg/ml、POAG(19.188±2.885)pg/ml组明显高于APACG组(15.465±3.500)pg/ml(P<0.001),而CPACG组较P OAG组差异无统计学意义(P＞0.05)。3.房水中IL-38含量:CPACG组(78.894±14.974)pg/ml、POAG组(78.708±13.684)pg/ml明显高于ARC组(62.760±12.011)pg/ml(P<0.001),APACG组(56.035±7.630)pg/ml与ARC组(62.760±12.011)pg/ml差异无统计学意义(P＞0.05)。各青光眼组间比较:CPACG组(78.894±14.974)pg/ml、POAG组(78.708±13.684)pg/ml明显高于A PACG组(56.035±7.630)pg/ml(P<0.001),而CPACG组较POAG组差异无统计学意义(P＞0.05)。4.各组房水中IL-36Ra、IL-37、IL-38含量与各青光眼组患者平均R NFL厚度相关性分析:APACG组患者平均RNFL厚度与房水中IL-36Ra、IL-37、IL-38的含量均无显著相关性(P＞0.05);CPACG组、POAG组患者平均RNFL厚度与房水中IL-36Ra、IL-37含量均无显著相关性(P＞0.05),而与房水中IL-38浓度呈显著负相关性(r=-0.496,P=0.016;r=-0.560,P=0.005)。结论:CPACG、POAG患者房水中IL-36Ra、IL-37、IL-38的表达呈现升高趋势,尤其以IL-37、IL-38更为显著,且IL-38与CPACG、POA G的病情程度具有显著相关性,提示房水中IL-37、IL-38因子可能参与了CPACG、POAG的发生发展。

木质纤维素是地球上最为丰富的生物质资源。能够降解木质纤维素的纤维素酶和半纤维素酶在食品、饲料、纺织行业已获得广泛应用,在精细化学品和替代能源的生产方面也展现了巨大的应用潜力。以里氏木霉(Trichode)rma reesei、草酸青霉(Penicillium oxalicum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)等为代表的丝状真菌能够高效合Rapamycin使用方法成并分泌纤维素酶,是工业生产中纤维素酶的主要来源。纤维素酶的合成主要在转录水平受控。多种序列特异性的转录因子(sequence-specific transcription factors)发挥了激活或抑制纤维素酶基因转录的效应。转录因子的稳定性、亚细胞定位、与DNA/蛋白质的亲和力受磷酸化、泛素化、乙酰化等多种翻译后修饰过程的影响;许多转录因子结合DNA后,还需招募辅因子(cofactors)以协同调控转录。因此,寻找、鉴定与转录因子具有相互作用的蛋白,确认其中是否含有执行翻译后修饰的酶/蛋白、是否含有辅因子,是探索转录因子调控基因表达机制的重要研究内容。对基因、序列特异的转录因子及其相互作用蛋白几种元素相互作用复杂模式的研究,对于深层次揭示真核生物的基因转录调控机制具有重要的理论意义。同时,发现的与转录因子具有相互作用的蛋白还可能成为对纤维素酶生产菌株进行分子改造的靶点。研究具有深刻的理论意义和重要的实践意义。本文以重要的产纤维素酶的丝状真菌草酸青霉为研究对象,对直接调控纤维素酶基因表达的转录因子Ace1、间接调控纤维素酶基因表达的转录因子CrzA调控基因转录的机制进行了研究。捕捉并鉴定了与转录因子Ace1具有直接相互作用的F-box蛋白Fbx23,对其生物学功能进行了研究,提出了 Ace1受含有F-box蛋白Fbx23的泛素连接酶SCF复合物(Skp1,Cullin,F-box complex)控制,调控纤维素酶基因表达的可能机制。捕捉了与转录因子CrzA具有相互作用的蛋白,绘制了草酸青霉钙调磷酸酶-转录因子CrzA通路。论文的主要研究内容及结果如下:1.草酸青霉转录因子PoAce1相互作用蛋白的捕捉和鉴定转录因子Ace1最初被认为是纤维素酶基因表达的转录激活因子,也因此被命名(activator of cellulase expression)。但后续的研究发现,Ace1实质是纤维素酶基因表达的转录抑制因子。里氏木霉和草酸青霉中Ace1的缺失能够提Dibutyryl-cAMP抑制剂高纤维素酶的合成。但Ace1调控基因表达的机制尚未获得解析。使用蛋白质串联亲和纯化(tandem affinity purification,TAP)联合质谱(TAP-MS)技术,以草酸青霉Ace1(PoAce1)为诱饵,捕获并鉴定了与PoAce1具有相互作用的蛋白。在捕获的8个蛋白中,泛素连接酶SCF复合物的两种组分Skp1和F-box蛋白Fbx23的丰度位于前两位。SCF复合物的另外两个组分Rbx1和Cul1也被发现。结果显示,转录因子PoAce1与Rbxl-Cul1-Skp1-Fbx23构成的泛素连接酶SCF复合物密切相关。酵母双杂交的结果进一步支持了 PoAce1与SCF复合物中的Fbx23具有直接的相互作用。双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)的结果证实 PoAce1-Fbx23 的相互作用发生在细胞核内。SCFFbx23复合物(上标表示泛素连接酶中负责识别底物的可变F-box亚基)中Fbx23亚基起到识别并结合转录因子PoAce1作为底物的功能。2.草酸青霉F-box蛋白PoFbx23的功能研究研究了草酸青霉Fbx23(PoFbx23)在菌丝生长、无性发育、纤维素酶基因的转录以及纤维素酶合成等生命过程中的功能。PoFbx23定位于细胞核内,PoFbx23编码基因缺失(Δfbx23)菌株的生物量与出发株无区别,但无性分生孢子的生成受损,孢子数量下降。Δfbx23突变株中,位于孢子发生中心调控途径中的重要转录因子BrlA编码基因的转录显著下调,提示PoFbx23通过影响孢子发生中心途径间接调控分生孢子的生成。同时,孢子色素合成相关的双羟基萘烯(DHN)-黑色素合成通路(abr2→abr1→ayg1→arp1→arp2→alb1)中的各基因的转录水平也下调。相较出发株,Δfbx23突变株的纤维素酶、半纤维素酶和胞外蛋白分泌量显著提高,qPCR结果显示主要外切纤维素酶基因cbh1和内切纤维素酶基因eg1的转录量显著上调,表明PoFbx23通过调控纤维素酶编码基因的表达影响纤维素酶的合成。转录组数据也支持了Δfbx23突变株中主要纤维素酶和半纤维素酶基因表达上调。最主要的两个外切纤维素酶基因cbh1和cbh2、两个内切纤维素酶基因eg1/cel7B和eg2/cel5B、内切β-葡萄糖苷酶基因bgl1、木聚糖酶基因xyn10A和xyn11A、辅助纤维素降解的裂解多糖单加氧酶(LPMO)基因AA9均显著上调GMO biosafety。此外,PoFbx23还与次级代谢基因簇的表达相关。草酸青霉基因组中预测的28个基因簇中,有4簇在Δfbx23突变株中表达下调。相较出发株,Δfbx23突变株中转录因子PoAce1的蛋白丰度提高,但ace1基因的转录量并未上升。结果提示,Pofbx23基因的缺失主要在蛋白合成/降解水平影响了 PoAce1的丰度。提出了转录因子Ace1受泛素连接酶SCFFbx23控制,调控纤维素酶基因表达的可能机制:转录抑制因子Ace1的无活性前体经SCFFbx23识别被泛素化,后被蛋白酶体降解成有活性状态,行使其抑制纤维素酶基因表达的功能。3.转录因子CrzA的相互作用蛋白的捕捉和鉴定钙-钙调蛋白-钙调磷酸酶(calcium-calmodulin-calcineurin)信号途径能够感知环境信号并相应地协调真菌生长、发育和代谢,是真菌中保守的级联途径。转录因子Crz1/CrzA(calcineurin-responsive zinc finger)是该途径下游最重要的靶标之一,参与多种真菌的各种生命过程,如菌丝生长、细胞壁完整性、有性/无性发育、钙稳态、抗逆性、毒力、次级代谢产物合成等。对于转录因子CrzA功能的研究一直是丝状真菌研究领域中的热点。在实验室前期鉴定了草酸青霉CrzA(PoCrzA)基本生物学功能的研究基础上,通过TAP-MS技术捕获并鉴定了与PoCrzA具有相互作用的蛋白。发现了 50个与PoCrzA具有潜在相互作用的蛋白,其中包括:钙调磷酸酶的催化亚基(Cna1,calcineurin A)、钙调磷酸酶的调节亚基(Cnb1,calcineurin B)、14-3-3蛋白Bmh1。还发现了两种与核蛋白运输相关的蛋白—核输出蛋白Los1和核输入蛋白Srp1、两种磷酸激酶Fus3和Slt2p、以及转录辅因子Tup1-Cyc8复合物的亚基Cyc8。基于TAP-MS结果,绘制了草酸青霉中钙调磷酸酶-转录因子CrzA通路,提出了 Tup1-Cyc8复合物可能作为PoCrzA的辅因子参与转录调控的猜想。

随着人类活动的加剧和工业化进程的快速发展,过量的氮素被排放到水体中,给生态平衡和人体健康带来严重危害。因此如何高效可持续去除水体中的氮素污染是环境治理面临的一个重要挑战。生物脱氮法因其绿色环保且经济有效的特点被广泛应用,新型生物脱氮技术尤其是好氧反硝化微生物的发现为生物脱氮提供了新的思路,成为目前污水处理领域研究的热点。然而对于常年处于低温环境或是冬季的水体,中温好氧反硝化菌的生长代谢和脱氮性能会受到严重抑制,难以达到含氮废水生物处理的要求。因此分离筛选耐冷好氧反硝化菌,并对其反硝化脱氮和耐冷机制进行解析,能够为更好实现低温环境下的高效生物脱氮提供理论依据和技术支撑。本研究主要是在筛选获得耐冷反硝化芽孢杆菌的基础上,通过耐冷特性实验结合转录组学分析,阐释该菌在反硝化过程中的耐冷机制,并对预测到的候选反硝化基因进行功能验证,最后对所制备的改性生物炭固定化芽孢杆菌的除氮效能进行了评估,主要研究成果如下:(1)从来源于我国东北地区的高山冻土样品中经过分离筛选和鉴定,获得了一株耐冷简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)H-b,该菌在5-37°C范围内对各类无机氮素均能有效去除。在5°C培养168 h,该菌对NO_3~–N、NO_2~–N和NH_4~+-N的去除效率分别达到40.07%、61.56%和73.83%,并且在低温条件下对混合氮源以及实际含氨氮污水均有良好的脱除效果。通过对N_2生成量的测定、氮平衡估算、反硝化基因(nap和nor)扩增以及关键功能酶(HAO、NR和NIR)酶活力表征等的分析,明确菌株H-b中具体反硝化脱氮途径为:NO_3~-～NO_2~-～NO～N_2O～N_2。此外,在低温条件下,以丁二酸钠作为碳源,Na Cl浓度为0-10 g/L,C/N比为15-20,p H为7-9,初始NO_3~–N浓度为10-60 mg/L,摇床转速为150-200 rpm以及Cu~(2+)、Zn~(2+)和Ni~(2+)浓度不超过2 mg/L的条件下,菌株H-b能够取得较佳的氮去除效率。(2)菌株H-b全基因组测序结果表明该菌基因组序列全长为5499613 bp,由一个Antibiotic combination环状染色体组成,基因组上共有5706个编码基因,其中有33个基因可能与菌株H-b的耐冷性相关。对菌株H-b在不同培养温度(5°C、20°C和30°C)下进行好氧反硝化过程转录组测序结果的分析,结合耐冷特性实验结果,发现在低温下菌株H-b大量调整参与膜转运、辅酶和维生素的合成以及转录调控因子相关基因的转录水平。此外,ATP(腺苷三磷酸)的合成、氮素的利用、EPS(胞外聚合物)的合成、脂肪酸组成、核苷酸前体的合成、蛋白翻译、氧化以及温度响应机制也做出了相应地调节。总之,菌株H-b通过调节胞内各项代谢过程共同应对低温生存压力。(3)利用序列比对和蛋白保守结构域分析从菌株H-b基因组序列上共预测到25个候选反硝化基因。首先建立了该菌的原生质体转化法,然后利用同源重组方式成功构建了25个候选基因敲除菌。发现H-bΔnap A2在低温下的生长出现明显的延滞现象,当基因回补后,回补菌株对低温环境的耐受能力有所恢复,说明nap A2是菌株H-b能够在低温下生长和脱氮的重要基因。cba A1敲除后,突变株无法在NO_3~–N和NO_2~–N培养基中生长,同时也无法脱氮,基因回补菌能够重新利用无机氮进行生长,且能通过反硝化途径产生N_2,表明了cba A1在菌株H-b的无机氮代谢过程中具有重要作用。此外,发现nor D、nor Imidazole ketone erastin半抑制浓度Q2、cba A2、cba A3、cba B1、nos F1、nos F3、nos F6、nos F02、nos Y1和nos Y2敲除后,11株突变株通过反硝化途径产生的N_2含量降低了6.06-32.89%不等。(4)以核桃壳为MRTX1133原材料,制备的4种金属改性生物炭中仅有锌和铁改性生物炭具有NO_2~–N吸附性能,在48 h时可以分别将29.13%和92.44%的NO_2~–N从溶液中去除。通过对锌和铁改性生物炭吸附特性和吸附动力学的分析,以对NO_2~–N吸附性能更优良的铁改性生物炭作为载体,制备了固定化B.simplex H-b。在温度为5-37°C以及初始NO_2~–N浓度为5-100 mg/L条件下,固定化菌株H-b相比于纯菌和单纯生物炭具有更高的氮去除效率。且当温度≤20°C以及初始NO_2~–N浓度≥40 mg/L时,改性生物炭上固定有高生物量的菌株H-b时,更有利于固定化细胞的脱氮作用。此外,改性生物炭固定化细胞重复使用10次后,对NO_2~–N的去除率仍能达到97.62%。

大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)是我国的主栽蔬菜作物,以叶球为主要产品器官,在蔬菜周年供应中占据重要地位。大白菜的结球性决定了产量和产品质量,历来受到研究者的重视。本人所在团队以结球白菜DH系‘FT’为试材,采用EMS诱变萌动种子的方法,创建了一个包含718份突变材料的突变体库。本研究从这一突变体库中筛选11份平塌型不结球突变体,在表型鉴定和遗传特性分析的基础上,利用Mutmap基因定位方法,结合KASP基因分型验证和Sanger测序分析,定位了相应的突变基因,并通过等位突变体序列变异分析,验证了基因功能。主要研究结果如下:1.证明了从突变体库Nirmatrelvir研究购买中筛选出的的11份平塌型不结球突变体的突变性状均由单隐性核基因控制,来自4对基因的突变供试的11份大白菜平塌型不结球突变体的表型性状相近,全生育期植株塌地而生,不能形成叶球。6世代遗传分析结果证明了其不结球表型均由单隐性核基因控制;突变基因等位性检测结果证明了11份突变体来自4对基因的等位变异:(1)突变基因Brlfm1,涉及lfm1-1和lfm1-2两个突变体;(2)突变基因Brlfm2,涉及lfm2-1、lfm2-2和lfm2-3三个突变体;(3)突变基因Brlfm3,涉及lfm3-1、lfm3-2、lfm3-3和lfm3-4四个突变体;(4)突变基因Brlfm4,涉及lfm4-1和lfm4-2两个突变体。2.证明了大白菜赤霉素合成关键基因Br KAO2、Br KS和Br CPS通过调控赤霉素生物合成影响大白菜叶球形成采用Mutmap定位方法,将突变基因Brlfm1、Brlfm2和Brlfm3分别定位到A05、A07和A09染色体上;利用KASP基因分型技术对候选SNP进行共分离验证,证明了Bra A05g012440.3C为Brlfm1的候选基因,Bra A07g043370.3.5C为Brlfm2的候选基因,Bra A09g001510.3.5C为Brlfm3的候选基因。这3个基因分别编码赤霉素生物合成途径中的3个关键酶KAO2、KS和CPS。克隆测序结果显示,lfm1-1在Br KAO2的CDS序列第455位发生了由G变为A的碱基替换,引起所在氨基酸由甘氨酸(Gly,G)变为谷氨酸(Glu,E);lfm1-2在Br KAO2的CDS序列第389位发生了由C到T的碱基替换,导致所在氨基酸由丝氨酸(Ser,S)变为亮氨酸(Leu,L)。lfm2-1的Br KS第九个内含子最后一个碱基由G变为A,导致CDS序列第1424位发生了8bp的缺失,引起了移coronavirus infected disease码突变和蛋白质翻译的提前终止;lfm2-2在Br KS的CDS第1466位由G变为A,导致所在氨基酸由精氨酸(Arg,R)变为赖氨酸(K);lfm2-3在Br KS的CDS第2032位由G变为A,导致所在氨基酸由谷氨酸(Glu,E)变为赖氨酸(Lys,K)。lfm3-1的Br CPS第六个内含子的最后一个碱基由G变为A,造成CDS序列上32bp的缺失,引起了移码突变和蛋白质翻译提前终止;lfm3-2在Br CPS的CDS序列第799位由C突变为T,导致所在氨基酸由组氨酸(His,H)变为酪氨酸(Tyr,Y);lfm3-3的Br CPS第三个内含子的最后一个碱基由G突变为A,导致CDS序列上5bp缺失,引起了氨基酸替换和蛋白质翻译提前终止;lfm3-4的Br CPS的第十二个内含子的最后一个碱基由G突变为A,导致CDS序列第1902处G的缺失,造成了氨基酸的替换和蛋白质翻译提前终止。上述9份突变体中的3组等位变异材料的序列分析验证了3个候选基因的功能。突变体赤霉素含量显著降低,外源赤霉素能使突变体恢复野生型表型。3.证明了芸薹属孤基因BOG1参与了大白菜叶球形成利用不结球突变体lfm4-1和野生型‘FT’构建F3-MA采购_2分离群体,采用Mutmap基因定位方法,将突变基因Brlfm4定位于A05染色体13.75Mb的区间。通过对定位区间内SNP筛选和注释,筛选到2个非同义SNP,涉及2个基因。KASP基因分型鉴定和Sanger测序分析结果表明,只有SNP A05 15078406与F_2突变表型共分离,因此,确定该SNP所在基因Bra A05g021450.3C为Brlfm4的候选基因。克隆测序结果表明,lfm4-1的Bra A05g021450.3C的第271位碱基发生了由G到A的替换,导致了所在氨基酸由丙氨酸(Ala,A)变为苏氨酸(Thr,T),使得蛋白质的二级结构及三维结构均发生了变化。等位突变体lfm4-2在Bra A05g021450.3C的第266位碱基存在一个非同义SNP(G到A),导致所在氨基酸由精氨酸(Arg,R)变为组氨酸(His,H),同样使得蛋白质的二级结构及三维结构发生了变化,这一结果验证了候选基因的功能。Bra A05g021450.3C编码一个13.74k Da的未知功能蛋白,同源物检索发现,其仅存在于芸薹属的A和C基因组,是芸薹属的一个孤基因,命名为BOG1(Brassica Orphan Gene 1)。BOG1无跨膜结构域,无信号肽。亚细胞定位结果显示BOG1位于细胞核内。突变体lfm4-1的活性赤霉素总含量显著降低,外源赤霉素能使突变体恢复野生型表型,外源喷施赤霉素抑制剂可使野生型变为突变体表型,说明BOG1可能通过调控赤霉素生物合成影响大白菜结球。

作为目前唯一已知定位于溶酶体、吞噬体内的巯基还原酶,γ-干扰素诱导的溶酶体硫醇还原酶(gamma-interferon-inducible lysosomal thiol reductase,GILT)在抗原递呈细胞中组成性表达,并在其他细胞中诱导表达,进而改变细胞氧化还原状态,调节线粒体自噬、磷酸化、细胞增殖等细胞生理功能。此外,GILT能促进CD8~+T细胞对MHCⅠ类分子限tethered spinal cord制性抗原的识别,并参与机体的抗病毒免疫反应,甚至改变肿瘤细胞的敏感性。作为IFN–γ的诱导型还原酶,GILT与脊椎动物自身免疫性疾病和肿瘤的限制性感染密切相关,并具有中和细菌感染诱导的胞外病原体,进而清除胞外碎片的免疫功能。但是,无脊椎动物的GILT功能研究尚不明确,目前已知的是病原相关分子模式和细菌均能诱导GILT的高表达,并与革兰氏阴性菌的清除有关。为进一步探究GILT在无脊椎动物中的免疫功能,本论文选取了我国重要特色经济养殖动物—中华绒螯蟹为研究对象,结合该蟹养殖过程中常遭遇细菌性病害的生产实际,对其GILT基因的抗菌功能进行了研究。本论文首先从中华绒螯JNJ-42756493纯度蟹基因组和转录组中获得并鉴定了GILT的c DNA序列,命名为Es GILT。多序列比对结果表明,Es GILT与其他物种具有较高的序列相似性,且GILT相关特征序列(CQHGX2ECX2NX4C)完全一致。系统发育树结果表明,Es GILT与其他无脊椎动物GILT蛋白处于同一进化分支,呈现进化上的保守性。组织分布结果表明,Es GILT在中华绒螯蟹血细胞和鳃等免疫器官中高表达。细菌感染结果发现,Es GILT在副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌感染后6小时的血细胞中出现表达量的显著上调,表明该基因对中华绒螯蟹固有免疫的调控功能。为进一步探究Es GILT的免疫学功能,本论文构建了原核表达r Es GILT蛋白,发现该蛋白在酸性环境中具有硫醇还原酶活性,可催Laduviglusib化小鼠Ig G的二硫键还原,且r Es GILT可通过识别副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌表面多糖以结合细菌。此外,还发现r Es GILT能够促进血细胞对细菌的凝集效率,提升血细胞对细菌的吞噬能力,抑制血细胞在细菌感染后的凋亡等功能,从而显著提高血细胞对细菌的清除效率。同时中华绒螯蟹血细胞中Es GILT的敲降会导致抗菌肽表达抑制及血淋巴细菌清除能力的下降。综上所述,中华绒螯蟹Es GILT参与抗菌免疫相关途径。通过促进血细胞对细菌的结合、凝集、清除及吞噬作用,抑制细胞凋亡参与细胞免疫应答。并调控抗菌肽表达参与体液免疫应答。该研究揭示了GILT在中华绒螯蟹抗菌免疫反应中的意义,延伸了GILT在甲壳动物先天免疫中的功能研究。

CB-839配制目的 探讨冠心病合并2型糖尿病的发病与CCL21基因rs2812377多态位点基因频率的改变是否存在相关关系，进一步分析CCL21基因rs2812377多态与冠心病合并2型糖尿病患者血浆中CCL21表达水平是否相关。方法 选取自2009年3月至2011年9月北部战区medical therapies总医院心血管内科收治的225例冠心病合并2型糖尿病患者为研究对象，并设为冠心病合并2型糖尿病组。另纳入同期因胸痛入院但冠状动脉造影证实其冠状动脉主支无狭窄且不满足糖尿病诊断标准的95例患者设为正常对R428生产商照组。应用酶联免疫吸附实验检测两组研究对象血浆中趋化因子CCL21的表达水平。应用Mass array飞行质谱分析仪对CCL21基因rs2812377单核苷酸多态位点3个基因型TT/GT/GG特点进行分析验证。结果 两组研究对象的趋化因子基因CCL21基因rs2812377多态位点TT型、GT型和GG型3种基因型频率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。CCL21基因rs2812377多态位点T等位基因在冠心病合并2型糖尿病人群的分布频率为33.78%,低于对照人群的44.21%;而G等位基因在冠心病合并2型糖尿病的分布频率为66.22%,高于对照人群的55.79%,差异均有统计学意义(P<0.05)。冠心病合并2型糖尿病组血浆中CCL21水平为(844.73±146.82)pg/ml,高于正常对照组的(507.77±103.62)pg/ml,差异有统计学意义(P<0.05)。冠心病合并2型糖尿病组血浆中TT+GT基因型携带者血浆CCL21水平为(800.31±120.21)pg/ml,低于GG型基因型携带者的(925.79±129.90)pg/ml,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 趋化因子CCL21表达水平在冠心病合并2型糖尿病患者血浆中明显上调，CCL21基因rs2812377多肽位点G等位基因可能是冠心病合并2型糖尿病发病的危险因素。