目的原发性先天性青光眼(Primary congenital glaucoma,PCG)是一种罕见且严重的青光眼类型,它可带来视觉功能障碍,给患者及其家庭带来严重的经济和身心负担。在前期研究中,课题组通过全外显子测序在PCG家系中检测出一个新的候选致病基因P-A及其突变(c.580G>A,pE194K),且研究表明该突变位点具有致病性;此外,通过Hoechst33342/PI染色发现P-A突变(c.580G>A,p.E194K)诱导的凋亡细胞数增加,且流式细胞仪检测结果显示c.580G>A,p.E194K的细胞凋亡率约为28.23%,其中早期凋亡约为10.72%。在前期研究基础上,本课题继续探讨P-A突变(c.580G>A,p.E194K)对人源小梁网细胞凋亡的影响,以明确P-A在PCG中可能的致病机制,并补充诱发PCG的候选致病基因,为PCG患者的诊断和治疗提供新的思路。方法1.在P-A野生型质粒(P-A-pCMV6-Entry-Flag)中引入c.580G>A位点构建突变型真核表达质粒(P-A-pCMV6-c.580Smoothened AgonistG>A)。以人源小梁网细胞为实验对象,采用体外转染法分别将空载质粒、P-A野生型及突变型质粒转染小梁网细胞。以P-A为对照,探究P-A突变对小梁网细胞凋亡的影响。2.使用荧光光切Inflammatory biomarker显微镜检测各实验组细胞线粒体膜电位的变化,并观察各实验组细胞Annexin V-FITC凋亡染色结果。3.使用qRT-PCR和Western blot分别检测各实验组细胞凋亡相关分子mRNA水平和蛋白水平的表达情况。4.设计、合成并筛选shRNA干扰P-A突变蛋白表达,Western blot检测有明显变化的凋亡相关分子蛋白表达的情况。结果1.本研究成功构建了P-A突变的真核表达质粒(P-A-pCMV6-c.580G>A)。2.P-A突变的小梁网细胞呈现圆形、椭圆形或不规则形状,细胞间间隙增大且细胞间彼此分离,密度较P-A野生组明显降低;且P-A突变引起了小梁网细胞线粒体膜电位的下降。此外,Annexin V-FITC凋亡染色结果显示P-A突变诱导小梁网细胞出现凋亡现象。3.Western blot结果表明P-A突变可引起Bax、Caspase-3/-8/-9、细胞色素c的表达增加,Bcl-2表达下降,而Fas和TNFα则不受影响,qRT-PCR检测结果与上述基本一致。GSI-IX纯度4.与对照组相比,干扰P-A突变引起Bax、Caspase-3/-8/-9、细胞色素c的表达相对下降,而Bcl-2表达相对增加。结论本研究表明P-A突变可通过内源性凋亡途径诱导人源小梁网细胞发生凋亡。