水稻作为重要的粮食作物,其胚乳是最主要的食用部位。灌浆期的水稻胚乳由外向内依次包括糊粉层、亚糊粉层和淀粉胚乳三部分。其中糊粉层含有丰富的脂肪酸、维生素和微量元素,近来已提出通过增加糊粉层厚度改良谷物的营养品质。但是目前关于水稻糊粉层发育的分子机制还知之甚少,制约了这一策略在稻米营养品质改良中的应用。VP1(Viviparous 1)是B3转录因子家族的一个成员,是ABA(脱落酸)信号的重要调节因子,参与种子休眠。本研究发现OsVP1主要在水稻籽粒的糊粉层和胚中表达,除了参与水稻休眠调控,还会Post infectious renal scarring影响糊粉层发育。研究结果表明:与野生型相比,osvp1突变体有明显的穗发芽现象,同时糊粉层增厚。此外,本研究还分析了水稻另外两个B3转录因子PHS-B3a和PHS-B3b,研究发现它们突变后在高温高湿的环境下均会产生穗发芽现象。本研究的主要结果如下:1.OsVP1表达模式分析:通过荧光定量 PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)实验,我们检测了 OsVP1在不同组织以及受精后不同天数颖果中的表达,结果显示,营养器官中几乎检测不到OsVP1的表达;OsVP1在花后10天的发育颖果中Empagliflozin体内实验剂量开始表达,并在颖果发育后期持续高表达。对pOsVP1::GUS转基因植株的GUS染色结果显示:从10DAF(授粉后天数)开始,OsVP1主要在颖果背部糊粉层表达。2.利用CRISPR/Cas9技术成功构建了osvp1靶向突变体,并对突变体进行表型分析,发现与野生型相比,osvp1突变体具有明显的穗发芽现象。此外,osvp1突变体籽粒的背部糊粉层明显增厚。进一步对p1301Ubi-OsVP1-eGFP过表达转基因材料的考察发现,与野生型相比,OsVP1过表达系籽粒背部糊粉层厚度显著变薄,表明OsVP1参与水稻糊粉层发育的调控。3.糊粉层树脂切片结果显示,野生型和突变体糊粉层厚度差异主要是在籽粒背部,统计结果表明野生型仅有3-5层细胞,而突变体有4-7层细胞;其腹部糊粉层厚度没有差异。透射电镜观察发现,相比野生型,突变体的糊粉层变厚,且蛋白体增多,暗示着OsVP1可能参与了糊粉层分化。4.为了深入了解OsVP1调控水稻糊粉层发育的机制,本研究对野生型和突变体10DAF的糊粉层进行了转录组测序。结果显示,与野生型相比,在两个突变体中共检测到2479个差异表达基因,其中1422个基因表达上调,1057个基因表达下调;GO富集分析表明糊粉粒膜、泛素连接酶复合物等相关基因显著富集。KEGG分析发现这些差异表达基因主要参与光合作用、植物信号转导、谷胱甘肽代谢、糖酵解以及淀粉蔗糖代谢等一些重要代谢通路。其中,多个生长素相关基因在野生型和osvp1突变体中的表达发生了显著变化;此外,糊粉层特异表达基因OsNF-YB1在oshttps://www.selleck.cn/products/torin-1.htmlvp1突变体中的表达下降。5.通过比较糊粉层发育关键调控基因在野生型和osvp1中的表达,我们发现TWINKLE、OsDEK1、OsROS1a和RISBZ1在osvp1突变体中的表达都有所下调;至于Os VP1是否通过调控上述基因以参与糊粉层的发育还有待研究。6.本课题组前期发现PRC2基因OsFIE1也参与糊粉层的调控,osfie1突变体糊粉层较野生型显著增厚。进一步构建osfie1 osvp1双突,发现双突变体种子糊粉层较单突变体厚度显著增加。考虑到OsFIE1调控糊粉层厚度与赤霉素(GA)相关,于是在野生型和osvp1突变体始花期,我们利用GA处理其稻穗至花后30天。结果显示处理前后糊粉层厚度无显著差异,暗示OsVP1和OsFIE1调控糊粉层的发育可能不在同一个通路上。此外酵母双杂交以及荧光素酶互补等实验也显示二者并不存在互作。7.此外,我们还利用CRISPR/Cas9技术敲除了水稻B3转录因子家族的另外两个基因PHS-B3a和PHS-B3b。对两者突变体的表型分析结果显示,这两个基因突变后不会影响糊粉层的发育;但在高温高湿的环境下均会表现出穗发芽的表型。