研究的目的及意义:肾纤维化是慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)的常见特征,可引起细胞外基质分解减少及不受控制的炎症反应和肌成纤维细胞增生,最终导致正常肾脏结构破坏和肾脏丧失功能。在大数据时代,生物信息学中的各种算法也有利于筛选疾病相应的靶基因。机器学习技术(Machine learning techniques,MLTs)包括多重计算机算法,如随机森林(Random forest,RF)、广义线性模型(Generalized linear model,GLM)和支持向量机(Support vector machine,SVM)等,可以帮助挑选标记基因。5-甲基胞嘧啶(m5C)发生在胞嘧啶第五位的碳原子上,是一种高度丰富的RNA转录后修饰(Post-transcriptional modification,PTCM)。m5C因在许多不同的生物过程中的关键作用而被广泛研究。NSUN2是甲基转移酶核心成员,参与m5C修饰的发生。其通过调节m5C mRNA修饰来影响细胞生物学过程,包括细胞增殖、衰老和细胞迁移等。但是目前关于NSUN2及其介导的m5C RNA修饰对肾脏功能调控的作用尚未见相关报道。本研究意在探讨NSUN2对肾纤维化的作用及机制,为进一步明确肾纤维化的发生机理提供理论基础。方法:(1)检测NSUN2表达水平与肾纤维化的相关性:通过基因表达综合数据库下载肾纤维化相关数据集,采用RF和SVM-RFE算法分析m5C标记基因(NSUN2)与肾纤维化的相关性。临床上通过收取临床肾积水病人肾脏病理组织及血液标本,q PCR、Western Blot检测NSUN2在病变部位与正常肾组织中的表达差异,酶联免疫吸附反应(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISAPF-03084014溶解度)检测正常对照组及肾积水患者血浆NSUN2表达。利用C57BL/6J小鼠构建单侧输尿管结扎selleck NMR模型(Unilateral ureteral obstruction,UUO),小动物超声检测术后3d,7d小鼠肾脏组织形态,肾脏组织切片染色检测小鼠肾脏组织病理变化;Western Blot和ELISA分别检测小鼠肾脏组织和血浆中NSUN2的表达。体外利用TGF-β1处理肾小管上皮细胞HK-2,诱导纤维化,检测处理前后NSUN2表达水平变化。(2)NSUN2在肾纤维化过程中的作用:尾静脉注射AAV9病毒构建NSUN2敲低和过表达小鼠,然后建立各组UUO模型,超声检测各组小鼠肾脏形态,血肌酐、尿素氮检测肾功能变化,HE及Masson染色检测肾纤维化程度。体外利用野生型、NSUN2敲低及NSUN2稳定过表达HK-2细胞,检测纤维化指标。(3)分析NSUN2参与调控肾纤维化的作用途径:通过基因集富集分析GSEA(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)富集分析NSUN2可能的调控途径,选择铁死亡途径进行后续分析。铁死亡诱导剂(Erastin)或铁死亡抑制剂(Ferrostatin-1)与TGF-β1分别处理HK-2,Western Blot检测NSUN2的表达水平变化。利用铁死亡PCR微阵列检测TGF-β1处理前后HK-2细胞铁死亡相关基因表达变化,联合机器算法建立的肾纤维化与铁死亡相关预后基因,对模型的临床拟合度进行评估,选择GPX4作为NSUN2下游作用靶点进行后续分析。(4)探究NSUN2对GPX4的具体调控方式:体外利用斑点杂交检测NSUN2敲低、过表达对HK-2细胞总m5C丰度影响;mRNA甲基化免疫共沉淀(Methylated RNA Immunoprecipitation,Me RIP)检测NSUN2过表达组与对照组GPX4 m5C mRNA的富集。(5)NSUN2靶向药物:Western blot检测川芎和雷公藤对HK-2细胞中NSUN2表达的影响,最后通过Auto Dock软件探究川芎与NSUN2分子对接能力。结果:(1)肾纤维化组织中NSUN2表达下调:GSE15639中差异表达m5C相关基因为NSUN4、DNMT3A、NSUN2及NSUN6,GSE70528中差异m5C相关基因为NSUN2及YTDHF2。使用机器算法筛选发现NSUN2为肾纤维化关键m5C靶基因。临床肾积水患者肾纤维化组织及血液中NSUN2表达均低于对照组。小鼠UUO模型肾脏HE染色显示UUO组肾脏组织明显出现纤维化及肾小管扩张。免疫组化、Western blot、ELISA结果均显示UUO组小鼠细胞内及血清内NSUN2表达水平较Sham组下降(P<0.05)。体外利用TGF-β1构建纤维化细胞模型,显微镜下观察发现TGF-β1组与对照组比较HK-2细胞由不规则多边形变成长梭形,Western blot和PCR检测均发现NSUN2表达水平较对照组下降(P<0.05)。(2)NSUN2在肾纤维化过程中的作用:ELISA结果提示敲低NUSN2组小鼠血清中NSUN2变化较对照组下降(P<0.05);病理染色结果显示敲低NSUN2的肾纤维化组小鼠肾脏损伤较对照组更重,超声结果显示:敲低NUSN2组小鼠肾脏低密度灶较对照组下降(P<0.05),而过表达NUSN2组与对照组相比肾脏损伤familial genetic screening较轻(P<0.05)。(3)NSUN2调控肾纤维化的作用机制:NSUN2的功能富集分析表明,NSUN2可能通过参与甘油酯代谢、泛酸和COA生物合成、醚脂质代谢等铁死亡多种途径的调控肾纤维化进展,因此我们聚焦于铁死亡途径,通过铁死亡PCR阵列检测发现GPX4、HMOX2、SAT2、SLC39A8、AKR1B10等共18个基因存在差异表达。进一步利用机器算法筛选预后基因,发现PANX2、SAT2、HRAS、TP53可以作为肾纤维化的Marker基因,由于GPX4是铁死亡发生的关键基因,将其加入筛选所得预后基因中,机器算法检测发现GPX4在预测肾纤维化的发病率占有较高权重,最终选定GPX4进行进一步分析。(4)NSUN2对GPX4的具体调控方式:在HK-2细胞中斑点杂交结果显示NSUN2过表达后m5C修饰水平上升,NSUN2敲低后m5C修饰水平下降。TGF-β1诱导HK-2细胞纤维化后m5C修饰水平下降。RNA甲基化免疫共沉淀结果提示在HK-2细胞中m5C特异性抗体可以大量富集GPX4 mRNA。以上结果表明NSUN2介导的5-甲基胞嘧啶甲基化促进了GPX4 mRNA蛋白表达。(5)NSUN2靶向药物:川芎和雷公藤可促进NSUN2的表达,分子对接结果显示川芎与NSUN2对接效能较好(对接分数为-5.651)。结论:NSUN2通过m5C甲基化GPX4 mRNA水平抑制铁死亡,减缓肾纤维化的进程。