目的:核因子E2相关因子2(Nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)是氧化应激系统的关键因子。研究表明,Nrf2在多种肿瘤耐药过程中发挥重要作用。急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是骨髓和外周血中原始细胞和幼稚髓性细胞异常增生的血液系统恶性疾病。AML患者产生耐药是治疗失败的主要原因,是临床上治疗AML的主要挑战。AML患者化疗过程中容易引起DNA损伤,启动DNA修复途径,进而介导AML患者对化疗药物不敏感,从而产生耐药。然而,Nrf2是否通过影响DNA损伤修复途径促进AML耐药机制尚不清楚。本研究旨在探讨Nrf2对DNA损伤修复途径的影响,并探明其介导AML耐药的潜在分子机制。方法:1.收集正常健康供者、AML完全缓解及复发患者骨髓血。Ficoll分离液提取正常健康供者、AML完全缓解及复发患者骨髓单个核细胞,RIPA裂解液提取蛋白样品。Trizol提取总RNA,逆转录为c DNA。Western Blot、PT-PCR和免疫细胞化学(Immunocytochemistry,ICC)法分析Nrf2和8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(8-oxgnanine DNA glycosylase,OGG1)在正常健康供者、AML完全缓解及复发患者中的表达情况。根据PT-PCR结果以Nrf2 m RNA表达量的中位数为截断值将AML临床样本分为Nrf2高表达(Nrf2-High)组和Nrf2低表达(Nrf2-Low)组。2.采用低浓度药物培养法诱导AML耐药细胞株,CCK-8法检测耐药细胞系和敏感细胞系的IC50值。同时采用免疫荧光(Immunofluorescence,IF)检测敏感和耐药细胞系中OGG1的表达情况。Western Blot和PT-PCR检测敏感和耐药细胞系中Nrf2的表达水平。3.慢病毒转染法构建过表达和沉默Nrf2的AML细胞系,免疫荧光显微镜观察慢病毒转染效率,同时使用Western Blot检测调控Nrf2后OGG1的表达情况。采用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测调控Nrf2后AML细胞对阿糖胞苷(cytarabine,Ara-C)的敏感性。同时检测Ara-C联合OGG1抑制剂共培养细胞24 h后AML细胞的凋亡率。4.采用染malaria-HIV coinfection色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,Ch IP)检测Nrf2和OGG1启动子之间是否存在相互作用。5.采用GEPIA数据库分析Nrf2和OGG1在配对正常样本和AML肿瘤样本中的表达水平,并用Gene Mania蛋白质数据库和Western Blot分析Nrf2、OGG1和AKT信号通路与AML耐药之间的关系。进一步用AKT信号通路抑制剂MK-2206(2μM)预处理细胞24 h后,Western Blot检测相关通路蛋白的表达水平。6.选取4-6周龄的非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷(non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency,NOD/SCID)雄性小鼠构建异种移植瘤模型。通过皮下注射AML细胞构建AML模型小鼠。每隔一天观察小鼠的生长状况,当小鼠肿瘤可触及时立即接受化疗药物Ara-C治疗。待小鼠牺牲后,取出皮下肿瘤,采用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)检测瘤组织中Nrf2和OGG1的表达情况,并验证调控Nrf2后在体内对小鼠生存的影响。7.本研究采用SPSS 19.0软件进行数据统计和处理,Image J软件进行蛋白条带的灰度值和荧光强度的分析,图形的绘制最后采用Graph Pad Prism 7.0软件。两组间数据分析采用独立样本t检验,多组间数据分析采用单因素方差分析。实验数据以均数±标准差表示。P值的含义为:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。其中,P<0.05认为具有统计学意义。结果:1.在临床样本中,本研究发现Nrf2高表达与AML疾病复发密切相关。进一步研究表明,Nrf2高表达与DNA损伤修复通路中的碱基切除(Base excision repair,BER)通路密切相关。在临床样本中检测Nrf2-High和Nrf2-Low组中BER切除修复通路基因(OGG1LY2835219、APE1、POL-β、XRCC1)中的表达情况,结果发现,Nrf2-High组中OGG1表达显著升高。Western Blot结果显示,在Nrf2-High组中OGG1蛋白表达水平显著升高,而在Nrf2-Low组中OGG1蛋白水平显著降低。2.Nrf2和OGG1在耐药细胞系中表达均显著升高,且耐药细胞系对Ara-C的敏感性降低,具有更高的耐药倍数。3.慢病毒转染AML细胞后发现,在上调Nrf2组中OGG1蛋白表达升高,白血病细胞对化疗药物Ara-C的敏感性降低,在体外具有保护AML细胞的作用;而在下调Nrf2组中OGG1蛋白表达降selleck抑制剂低,导致白血病细胞对化疗药物Ara-C的敏感性增加,细胞凋亡显著增加。当使用OGG1抑制剂TH5487抑制OGG1的表达后,上调Nrf2组AML细胞对Ara-C的敏感性增加。Ch IP实验结果显示,Nrf2和OGG1启动子结合增强了Nrf2-OGG1轴的功能。4.在AML细胞中Nrf2过表达激活了AKT信号通路,促进OGG1蛋白的表达。当AKT信号通路抑制剂与AML细胞共培养24 h后发现在Nrf2过表达组中OGG1蛋白表达降低,同时Ch IP结果提示,使用AKT通路抑制剂后,Nrf2和OGG1启动子的结合显著降低。5.体内研究结果提示,下调Nrf2后AML模型小鼠瘤组织生长缓慢,生存期较长。同时在Nrf2下调组中OGG1表达降低,对异种移植瘤小鼠具有一定的保护作用。结论:过表达Nrf2促进OGG1表达降低AML细胞对Ara-C的敏感性。进一步研究发现Nrf2过表达激活了AKT信号通路促进OGG1表达介导了AML细胞对Ara-C耐药。