【目的】本研究以体外培养的人肾近曲小管细胞(HK-2)为研究对象。首先,明确在高糖环境下HK-2细胞发生上皮间质转化(EMT),而人骨髓间充质干细胞(MSC)能够改善高糖下HK-2细胞EMT。其次,通过转录组测序分析,探索MSC影响细胞EMT的可能作用机制——铁死亡。最后,验证MSC是否通过干预铁死亡影响HK-2细胞EMT。【方法】1.MSC对高糖条件下肾小管上皮细胞EMT的影响在体外对HK-2细胞进行细胞处理后,将细胞随机分为4组:对照组(CON):5.6m M葡萄糖;甘露醇组(MN):5.6m M葡萄糖+24.4m M甘selleck露醇;高糖组(HG):30m M葡萄糖;以及高糖+MSC组(HG+MSC):30m M葡萄糖+MSC。通过细胞增殖-毒性检测法(CCK-8)检测0h、24h、48h、72h及96h各组细胞增殖活力。采用免疫荧光共染检测各组细胞上皮细胞标志蛋白E-cadherin及间质细胞标志蛋白α-SMA水平。采用免疫印迹法检测各组细胞E-cadherin、α-SMA及内参蛋白β-actin水平。2.MSC影响肾小管上皮细胞EMT的可能作用机制将细胞随机分为3组:CON组、HG组、HG+MSC组。每组分别处理48h后收集细胞进行转录组测序。根据测序所得到的两组差异表达基因(HG组vs.CON组,HG组vs.MSC组),首先绘制Venn图取交集得到共表达差异基因,再利用基因聚类分析、GO富集分析、KEGG通路富集分析等生物信息学方法,对所获得的共表达差异基因进行功能注释及相关通路筛选。3.MSC通过干预铁死亡影响肾小管上皮细胞EMT3.1铁死亡对高糖诱导的肾小管上皮细胞EMT的影响将细胞随机分为4组:CON组、HG组、Erastin组:5.6m M葡萄糖+10μM Erastin,以及HG+Fer-1组:30m M葡萄糖+80μM Fer-1。细胞干预处理后,采用细胞增殖-毒性检测法检测各组细胞增殖活力。采用DCFH-DA法及流式细胞仪检测各组细胞内活性氧(ROS)水平。通过透射电镜观察各组细胞线粒体形态。通过相应试剂盒检测各组细胞丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、脂质过氧化产物(Lipid peroxidation,LPO)、总铁离子、亚铁离子、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)、还原型谷胱甘肽(Reduced glutathione,GSH)及氧化型谷胱甘肽(Oxydized glutathCell Biologyione,GSSG)水平。采用免疫荧光共染检测各组细胞E-cadherin、Vimentin及α-SMA水平。3.2 MSC通过干预铁死亡影响高糖诱导的肾小管上皮细胞EMT将细胞随机分为5组:CON组、HG组、HG+MSC组、HG+Fer-1组、HG+MSC+Erastin组:30m M葡萄糖+MSC+10μM Erastin。细胞干预处理后,采用细胞增殖-毒性检测法检测各组细胞增殖活力。采用DCFH-DA法及流式细胞仪检测各组细胞内ROS水平。通过透射电镜观察各组细胞线粒体形态。通过相应试剂盒检测各组细胞MDA、LPO、总铁离子、亚铁离子、NADPH、GSH及GSSG水平。采用免疫荧光共染检测各组细胞E-cadherin、Vimentin及α-SMA水平。【结果】1.MSC改善高糖条件下肾小管上皮细胞EMT与CON组相比,HG组细胞增殖活力显著下降,E-cadherin水平明显降低,α-SMA水平明显升高;与HG组相比,HG+MSC组细胞增殖活力显著上升,E-cadherin水平明显升高,α-SMA水平明显降低。2.MSC影响细胞EMT的可能作用机制在HG组vs.CON组中,共筛选出1161个显著差异表达基因、富集到302条相关信号通路。在HG组vs.MSC组中,共筛选出1213个显著差异表达基因、富集到290条相关信号通路。通过Venn图对两组数据取交集,进一步关联分析得到480个共表达差异基因及274条共有显著性通路,其中包括铁死亡通路及相关基因。3.MSC通过干预铁死亡改善肾小管上皮细胞EMT3.1铁死亡参与高糖诱导的肾小管上皮细胞EMT与CON组相比,HG组与Erastin组细胞增殖活力显著下降,细胞内ROS、脂质过氧化产物、总铁及亚铁离子、GSSG、Vimentin及α-SMA水平明显升高,部分线粒体嵴断裂并出现空泡化,NADPH、GSH、GSH/GSSG及E-cadherin水平明显降低;与HG组相比,HG+Fer-1组细胞增殖活力显著上升,细胞内ROS、脂质过氧化产物、总铁及亚铁离子、GSSG、Vimentin及α-SMA水平明显降低,大部分线粒体结构正常,NADPH、GSH、GSH/GSSG及E-cadherin水平明显升高。3.2 MSC抑制铁死亡缓解高糖诱导的肾小管上皮细胞EMT与HG组相比,HG+MSC组与HG+Fer-1组细胞增殖活力显著上升,细胞内ROS、脂质过氧化产物、总铁及亚铁离子、GSSG水平明显降低,线粒体及线粒体嵴未见异常,NADPH及GSH水平明显升高;与CobimetinibHG+MSC组相比,HG+MSC+Erastin组细胞增殖活力显著下降,细胞内ROS、脂质过氧化产物、总铁及亚铁离子、GSSG水平明显升高,线粒体出现肿胀、线粒体嵴部分断裂,NADPH及GSH水平明显降低。【结论】高糖条件能够刺激肾小管上皮细胞发生EMT,铁死亡参与了高糖条件下肾小管上皮细胞EMT,而MSC能够通过抑制铁死亡从而缓解肾小管上皮细胞EMT。