中枢神经系统(Central nervous system,CNS)炎性脱髓鞘疾病(Inflam-matory demyelinating disease,IDDs)是一组以髓鞘脱失和炎症相关的轴突损伤为特征的异质性疾病,其中多发性硬化(Multiple sclerosis,MS)和视神经脊髓炎谱系疾病(Neuromyelitis optica spectrum disorders,NMOSD)是最常见的疾病类型。MS和NMOSD在中青年人群中高发,病变部位主要累及脊髓、视神经和大脑,患者常表现为运动和视觉障碍、感觉异常及精神异常等,最终导致不可逆的严重神经功能缺损。IDDs的确切病因和发病机制尚不明确,遗传和环境因素的共同作用导致了自身免疫反应。脱髓鞘患者中枢神经系统中免疫介导的损伤是由多种免疫细胞的复杂相互作用引起的,其中T淋巴细胞和B淋巴细胞是关键介质,分别介导了体液免疫和细胞免疫反应。CD4~+T细胞在MS的发病中发挥着至关重要的作用。Naive CD4~+T细胞可以分化为具有免疫抑制作用的调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg)和促进炎症的辅助性T细胞(Helper T cell,Th),如Th1和Th17细胞。Th17细胞分泌粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)和白介素17(Interleukin 17,IL-17)等多种细胞因子,是导致MS发病的主要细胞类型之一。而Treg通过介导对自身抗原的免疫耐受来抑制自身免疫反应。在MS中,Th17细胞和Treg细胞之间的平衡被打破。NMOSD虽然是以体液免疫为主的自身免疫性疾病,但许多证据表明,NMOSD中存在特异性识别水通道蛋白4(Aquaporin 4 antibody,AQP4)的自身反应性T细胞,Th17/Treg比例失衡,Th17、Treg及其相关细胞因子在NMOSD的发病机制中也发挥着重要作用。自噬是一种细胞内降解途径,通过消除有缺陷或多余的蛋白质、复合物和细胞器来维持细胞内稳态。大量研究表明,自噬在MS和中枢神经系统炎性脱髓鞘动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)的发病机制中发挥着关键作用。自噬通过降解受损的细胞器和异常蛋白来维持中枢神经系统的稳态,通过调节免疫细胞的激活和炎症因子的分泌参与炎症反应。有研究显示调节自噬可影响Th17/Treg平衡,用雷帕霉素等自噬诱导剂激活自噬,可以通过增加Treg细胞的数量,减轻EAE小鼠神经功能缺损和炎症反应。微小RNA(Micro RNA,miRNA)是长度为21-25个核苷酸的非编码RNA,可以与其靶信使RNA(Messenger RNA,m RNA)匹配位点相互作用,诱导m RNA的降解和翻译抑制,在转录后水平调控基因表达,是参与细胞功能调控的重要分子。miRNA作为表观遗传因子参与了中枢神经系统自身免疫性疾病的发展,目前在MS患者的免疫细胞和中枢神经系统中已经发现了大量异常表达的miRNA,miRNA表达失调与中枢神经系统病变密切相关。miR-133是一个包含miR-133a和miR-133b两种亚型的miRNA家族,在人类基因组中,miR-133a有两个高度相似的异构体miR-133a-1和miR-133a-2,二者转录加工而成的成熟体序列相同。miR-133a是一种肌肉特异性miRNA,在炎症反应中也发挥着至关重要的作用。最近的研究表明,在Ig A肾病中miR-133a或miR-133b通过抑制叉状头转录因子(Forkhead transcription factor,FOXP3)的表达显著降低了Treg数量。在多种肿瘤中miR-133a可以抑制自噬,改变自噬相关蛋白Beclin1、LC3B和P62等的表达。而miR-133a是否参与脱髓鞘疾病的发病机制尚不明确。探究miR-133a在中枢神经系统脱髓鞘患者中的表达、调控和功能,将为今后开发特异性miRNA作为诊断标志物和治疗靶点提供依据。miRNA不具有蛋白编码功能,需要通过对靶基因的转录调控发挥作用。以往的研究报道了miR-133a与沉默信息调节因子1(Silent information regulation 1,SIRT1)和细胞因子信号转导抑制因子2(Suppressors of cytokine signaling,SOCS2)的靶向关系,而SIRT1和SOCS2与炎症信号通路和自噬水平相关。有研究表明,miR-133a在脓毒症中通过抑制SIRT1的表达促进炎症反应,沉默SIRT1可以逆转miR-133a抑制剂的抗炎作用,且双荧光素酶实验验证了miR-133a和SIRT1的靶向关系。在骨关节炎模型和高脂血症模型中也证实了miR-133a和SIRT1的靶向关系。而miR-133a与SOCS2的相互作用在心肌损伤中得到过验证,研究显示在心肌再灌注损伤中miR-133a通过下调SOCS2抑制自噬。基于以上文献,我们猜测miR-133a可能通过负调控SOCS2和(或)SIRT1,参与调节自噬和炎症水平,在脱髓鞘疾病中发挥作用。本研究首先在CNS脱髓鞘患者和EAE小鼠中探讨了miR-133a以及相关基因的表达差异,证实了miR-133a在NMOSD和MS患者的PBMC以及EAE小鼠的脾和淋巴结中上调。通过EAE小鼠体内实验和体外CD4~+T细胞培养,抑制或过表达miR-133a,进一步探讨miR-133a及其靶基因是否通过调节自噬和炎症水平在EAE的病情进展中发挥作用,为今后开发特异性miRNA作为诊断标志物和治疗靶点提供实验依据。第一部分miR-133a在中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病患者外周血单个核细胞中的表达及功能分析目的:从NMOSD和MS患者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC)入手,结合NMOSD患者PBMC的ce RNA芯片组学分析,探索miR-133a及其潜在靶基因在中枢神经系统脱髓鞘疾病中的表达变化,分析其与患者临床特征的相关性,为揭示CNS炎性脱髓鞘的发病机制提供新的视角。方法:1.选取实验对象:2021年1月至2021年12月在河北医科大学第二医院神经内科就Ferrostatin-1采购诊的符合纳入和排除标准的NMOSD和MS患者,诊断标准符合《视神经脊髓炎谱系疾病的国际共识诊断标准(2015版)》或《多发性硬化诊断和治疗中国专家共识(2018版)》,抽取外周血并收集临床信息,选取同期体检中心年龄性别相匹配的健康者作为对照组。2.NMOSD、MS患者及对照者PBMC和selleck总RNA的提取:使用淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法提取外周血中的单个核细胞,将样品溶解在Trizol中,于-80℃冰箱保存以备使用。采用氯仿、异丙醇和乙醇法从PBMC中提取总RNA。3.应用RT-q PCR方法检测NMOSD、MS患者及对照者PBMC中miR-133a-1、miR-133a-2、miR-30d-5p、miR-204-5p和miR-29b-3p的表达情况,以及miR-133a的潜在靶基因SOCS2和SIRT1 m RNA的表达水平。4.分析急性期NMOSD患者PBMC中miR-133a-1、miR-133a-2、SOCS2 m RNA和SIRT1 m RNA水平与临床特征(EDSS评分及炎症水平)的相关性。5.分析ce RNA芯片中SOCS2、SIRT1及自噬相关基因的转录水平。结果:1.急性期NMOSD患者PBMC中miR-133a-1和miR-133a-2表达量较对照组显著升高(miR-133a-1,P=0.005;miR-133a-2,P=0.001),miR-133a-1和miR-133a-2表达水平呈显著正相关(r=0.553,P=0.005)。急性期MS患者中miR-133a-1有升高趋势但差异无统计学意义(P=0.126),miR-133a-2较对照组显著升高(P=0.03),miR-133a-1和miR-133a-2表达水平的相关性无统计学意义(r=0.691,P=0.196)。2.急性期NMOSD患者PBMC中miR-133a-1和miR-133a-2水平与患者EDSS评分之间未发现明显相关性,但在EDSS评分较高的患者中miR-133a的表达量有升高趋势。miR-133a-1与中性粒细胞和淋巴细胞比值(Neutrophil to lymphocyte ratio,NLR)有正相关的趋势(r=0.319,P=0.129)。miR-133a-2与患者血清IL-2呈正相关(r=0.493,P=0.038),与TNF-α有呈正相关的趋势但无统计学意义(r=0.437,P=0.070)。3.急性期NMOSD患者SOCS2 m RNA表达量较对照组显著下调(P=0.003)。SOCS2 m RNA水平与患者外周血淋巴细胞比率呈显著正相关(r=0.365,P=0.029),与中性粒细胞比率(r=-0.409,P=0.013)和NLR(r=-0.374,P=0.025)呈显著负相关。4.急性期NMOSD患者SIRT1 m RNA表达水平较对照组显著降低(P<0.0001)。SIRT1 m RNA与淋巴细胞比率显著正相关(r=0.5137,P=0.0006),与中性粒细胞比率负相关(r=-0.4785,P=0.0016),与NLR负相关(r=-0.4988,P=0.0006)。5.Ce RNA芯片数据显示NMOSD组SOCS2表达量较对照组显著下降(P=0.031),SIRT1表达量显著下降(P<0.001)。与对照组相比,NMOSD患者中自噬相关基因Beclin1表达量升高(P=0.005),LC3B表达量降低(P=0.006),P62表达量显著升高(P=0.04)。结论:本部分研究我们探讨了miR-133a在NMOSD和MS患者PBMC中的表达水平及其与临床指标的相关性。急性期NMOSD和MS患者PBMC中miR-133a-1和miR-133a-2显著升高,且与患者EDSS评分和炎症指标有一定关联。与miR-133a升高相反,NMOSD中SOCS2和SIRT1m RNA表达水平显著下降,自噬存在异常,故miR-133a有可能通过靶向SOCS2和(或)SIRT1影响自噬并参与NMOSD和MS的发病。第二部分抑制miR-133a通过调节自噬对实验性自身免疫性脑脊髓炎起保护作用目的:建立EAE动物模型,检测miR-133a-3p在EAE小鼠中的表达变化。用重组慢病毒质粒进行干预,在EAE小鼠中过表达或抑制miR-133a-3p,探究miR-133a-3p在EAE发病机制中的作用,并联合3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)阻断自噬,进一步验证miR-133a-3p是否通过调控自噬在EAE中发挥作用。方法:1.实验一miR-133a在实验性自身免疫性脑脊髓炎中表达升高1)实验动物及EAE模型建立:选用体重18±2g的雌性C57BL/6小鼠,用生理盐水将MOG35-55多肽稀释为10mg/ml,加入等体积的完全弗氏佐剂(Complete Freund's Adjuvant,CFA),以及一定量的结核杆菌H37Ra(其终浓度为4mg/ml)。将0.1ml充分乳化的混合液皮下注射于小鼠背部脊柱两侧任意四点,在MOG免疫第0h及第48h分别给予小鼠0.5ml百日咳毒素腹腔注射。2)EAE小鼠评分及取材:免疫后每天对EAE小鼠进行神经功能评分(Jager法)。于EAE小鼠发病高峰期时取材,液氮速冻后存放于-80℃冰箱。3)提取RNA,应用RT-q PCR方法检测miR-133a-3p,以及SOCS2、SIRT1、Beclin1、LC3B和P62 m RNA的表达水平。2实验二miR-133a通过影响自噬参与实验性自身免疫性脑脊髓炎发病机制1)实验动物及EAE模型建立(同实验一)2)慢病毒载体感染EAE小鼠,分组:mmu-miR-133a-3p空病毒对照组(LV-Con),mmu-miR-133a-3p模拟物组(LV-miR-133a),mmu-miR-133a-3p抑制剂组(LV-anti-miR-133a),在EAE造模前一周用携带上述质粒的重组慢病毒感染小鼠。造模后每日采用Jager法对EAE小鼠进行神经功能评分。3)于发病高峰期取材,脊髓腰膨大组织用石蜡包埋、切片,进行HE及LFB染色。4)提取RNA,应用RT-q PCR检测EAE脾组织miR-133a-3p、SOCS2、SIRT1、FOXP3、IFN-γ、RORC和IL-17 m RNA的表达。5)提取蛋白,用Western blot方法检测脾组织SOCS2、SIRT1、Beclin1、LC3II/I和P62蛋白表达量。3实验三自噬参与miR-133a抑制剂对实验性自身免疫性脑脊髓炎的保护作用1)实验动物及EAE模型建立(同实验一)2)用慢病毒载体和3-MA干预小鼠,分组:EAE组、mmu-miR-133a-3p抑制剂组(LV-anti-miR-133a)和mmu-miR-133a-3p抑制剂联合3-MA组(LV-anti-miR-133a+3-MA),在EAE造模前一周用携带上述质粒的重组慢病毒感染LV-anti-miR-133a和LV-anti-miR-133a+3-MA组的小鼠。自免疫后第1天起,联合3-MA干预组每日腹腔注射3-MA(10 mg/kg),其余2组小鼠腹腔注射等体积生理盐水。每日观察并记录小鼠神经功能评分。3)于EAE发病高峰期取材,使用淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法提取脾组织中的淋巴细胞,用Western blot方法检测Beclin1、LC3II/I、P62和FOXP3蛋白表达量。结果:1.实验一miR-133a在实验性自身免疫性脑脊髓炎中表达升高1)EAE小鼠发病情况:在MOG免疫后第12天起开始发病,于第19天取材时神经功能缺损评分均值达到2.438±1.084分,发病率为100%。2)EAE小鼠脾和淋巴结中miR-133a-3p表达量较对照组显著升高(Spleen:P=0.006;Lymphonodus:P=0.002)。EAE组脑和脊髓中miR-133a-3p表达水平较对照组无明显差异(Brain:P=0.818;Spinal cord:P=0.135)。3)与对照组相比,SOCS2 m RNA表达水平在EAE脾中有下降趋势,但差异无统计学意义(P=0.183)。SIRT1 m RNA在EAE脾中显著下调(P=0.038)。EAE组脾组织中Beclin1 m RNA显著上调(P=0.042),LC3B m RNA较对照组无明显差异(P=0.691),P62 m RNA显著上调(P=0.029)。2实验二miR-133a通过影响自噬参与实验性自身免疫性脑脊髓炎发病机制1)重组慢病毒感染EAE小鼠后,LV-miR-133a组miR-133a-3p表达较对照组显著升高(P=0.010),LV-anti-miR-133a组miimmunofluorescence antibody test (IFAT)R-133a-3p表达下降(P=0.038),表明转染效果显著。2)过表达miR-133a-3p导致EAE小鼠发病时间提前,神经功能缺损评分增加,延缓了高峰期后神经功能缺损症状的恢复,加重了CNS炎症浸润和脱髓鞘程度。而抑制miR-133a-3p对EAE起到保护作用,降低了神经功能缺损评分,减轻了炎症反应和脱髓鞘程度。3)过表达miR-133a-3p时SOCS2 m RNA和蛋白表达量较对照组显著下降(P=0.010;P=0.011)。抑制miR-133a-3p后,SOCS2 m RNA和蛋白表达量显著升高(P=0.002;P=0.031)。双荧光素酶实验验证了miR-133a-3p和SOCS2的直接靶向关系。而SIRT1 m RNA和蛋白水平在各组间无显著差异。4)过表达miR-133a-3p时,Beclin1蛋白表达下降(P=0.005),LC3II/I蛋白有降低趋势(P=0.053),P62蛋白升高(P<0.001),表明miR-133a-3p加重了自噬抑制,自噬流阻断。抑制miR-133a-3p时,Beclin1蛋白表达升高(P=0.005),P62蛋白降低(P<0.001),表明自噬通量增加。5)过表达miR-133a-3p组FOXP3 m RNA转录水平和对照组相比明显降低(P=0.026),miR-133a-3p抑制组FOXP3 m RNA转录水平较对照组升高(P=0.027)。3实验三自噬参与miR-133a抑制剂对实验性自身免疫性脑脊髓炎的保护作用1)抑制miR-133a-3p显著减轻了EAE小鼠神经功能缺损的严重程度,自噬抑制剂3-MA可部分抵消anti-miR-133a-3p对EAE的保护作用。与EAE组相比,anti-miR-133a组小鼠高峰期神经功能缺损评分显著降低(P=0.001),而anti-miR-133a+3-MA组疾病评分较anti-miR-133a组高(P=0.013)。2)与EAE组相比,抑制miR-133a-3p组LC3II/I蛋白升高(P=0.026),P62蛋白降低(P=0.022)。联合3-MA组LC3II/I蛋白水平较miR-133a抑制组降低(P=0.003),P62蛋白表达量较高但差异无统计学意义(P=0.539)。结果表明抑制miR-133a-3p改善了EAE小鼠脾淋巴细胞中自噬流受阻的程度,而3-MA部分阻断了其对恢复自噬通量的有益作用。3)miR-133a-3p抑制组中FOXP3蛋白表达较EAE组显著升高(P=0.043),联合3-MA阻断自噬后FOXP3水平呈降低趋势(P=0.120)。结论:本部分研究发现EAE小鼠脾和淋巴结中miR-133a-3p表达量显著升高。miR-133a-3p可能通过靶向SOCS2参与EAE的发病,而抑制miR-133a-3p对EAE小鼠具有保护作用。自噬参与了miR-133a-3p抑制剂对EAE的保护作用,阻断自噬可部分抵消miR-133a-3p抑制剂的作用。第三部分miR-133a在实验性自身免疫性脑脊髓炎CD4~+细胞中的作用机制研究目的:建立EAE动物模型,分选发病高峰期EAE小鼠脾中CD4~+细胞,过表达或抑制miR-133a-3p,探究miR-133a-3p在CD4~+细胞中的作用。方法:1.实验动物及EAE模型建立(同第二部分实验一)2.细胞转染:于发病高峰期取材,分离EAE小鼠脾细胞,用磁珠分选Naive CD4~+T细胞,使用无菌MOG35-55溶液进行再免疫,用CD3抗体和CD28抗体激活CD4~+T细胞,分别用miR-133a-3p模拟物(miR-133a-3p mimics)、模拟物对照(mimics NC),miR-133a-3p抑制剂(miR-133a-3p inhibitor)和抑制剂对照(inhibitor NC)转染细胞,72h后收集细胞。3.应用RT-q PCR方法检测miR-133a-3p,SOCS2和FOXP3 m RNA的表达。5.应用Western blot方法检测SOCS2、Beclin1、LC3II/I和P62蛋白表达量。6.采用ELISA方法检测CD4~+T细胞培养上清液中IFN-γ,IL-17,IL-10,IL-6细胞因子的含量。结果:1.miR-133a mimics组miR-133a-3p表达较对照组显著升高(P=0.029),miR-133a inhibitor组miR-133a-3p表达较对照组明显降低(P=0.030),表明转染效果显著。2.miR-133a-3p负调控SOCS2,过表达miR-133a-3p时SOCS2 m RNA水平呈下降趋势(P=0.087),SOCS2蛋白显著降低(P=0.036)。抑制miR-133a-3p时SOCS2 m RNA较对照组显著升高(P=0.007),SOCS2蛋白表达量也显著升高(P=0.009)。3.miR-133a-3p负调控自噬,在CD4~+细胞中过表达miR-133a-3p时,Beclin1蛋白有下降趋势(P=0.236),LC3II/I蛋白下降(P=0.002),P62蛋白显著升高(P=0.007)。抑制miR-133a-3p时Beclin1蛋白有升高趋势(P=0.400),LC3 II/I蛋白升高(P=0.013),P62蛋白降低(P=0.025),表明抑制miR-133a-3p可减轻自噬异常,恢复自噬流。4.过表达miR-133a-3p,FOXP3 m RNA(P=0.039)和蛋白(P=0.012)表达水平较对照组下降。抑制miR-133a-3p,FOXP3 m RNA(P=0.003)和蛋白(P=0.003)水平显著升高。5.miR-133a-3p过表达组细胞培养上清液中IL-6含量较mimics NC组显著升高(P=0.042),IL-17A,IFN-γ和IL-10无显著差异。miR-133a-3p抑制剂组IL-10含量较inhibitor NC组升高(P=0.014),而IL-6,IL-17A,IFN-γ差异无统计学意义。结论:本部分研究结果与体内研究结果一致,miR-133a-3p负调控SOCS2和自噬相关蛋白的表达,抑制EAE小鼠脾CD4~+T细胞中miR-133a-3p的表达,可减轻自噬异常,恢复自噬流,增加FOXP3的表达水平。