创伤性颞下颌关节(temporomandibular joint,TMJ)强直是一种会严重影响口腔颌面系统功能和生理形态的疾病,其临床表现为张口受限以及咀嚼困难等。目前,有关创伤性TMJ强直的发病假说较多,但无一种假说能够完整解释创伤性TMJ强直的发病机制。前期大量关于创伤性TMJ强直的动物模型研究表明,绵羊因其免疫力强、TMJ大小和解剖结构与人类的较为相似,是研究创伤性TMJ强直最常用到的实验动物。然而绵羊因其基因操控较为困难,且能够应用于绵羊的抗体较少,因此不适用于创伤性TMJ强直的发病机制研究。转基因小鼠虽便于操控基因,但小鼠TMJ结构太小,不利于手术模拟TMJ创伤。相较之下,大鼠兼备手术模拟创伤和基因可操控的优势。在创伤性TMJ强直发病过程中,巨噬细胞在TMJ损伤后的愈合早期调控软骨骨痂形成。在创伤性TMJ骨性强直的发病进程中,巨噬细胞与TMJ强直密切相关。我们课题组前期在绵羊TMJ骨性强直中发现明显有软骨骨化的现象,而软骨组织中唯一的细胞是软骨细胞,并且软骨骨化必经历软骨细胞的肥大化,因此推测软骨细胞肥大化和创伤性TMJ骨性强直存在密切关联。基于上述研究事实及分析,本项目拟采用复合创伤方法构建SD大鼠创dermatologic immune-related adverse event伤性TMJ强直动物模型,利用大体观察、Micro-CT影像学以及组织学检查等手段验证动物模型并确定SD大鼠TMJ强直类Galunisertib IC50型,旨在构建结果稳定、可重复性高和易于推广的SD大鼠创伤性TMJ强直动物模型。以SD大鼠创伤性TMJ强直动物模型为研究基础,采用RNA-seq检测术后对照组与各实验组的SD大鼠TMJ复合体总RNA,找到影响创伤性TMJ骨性强直的关键因子和关寻找更多键信号通路。分离并培养SD大鼠骨髓来源的巨噬细胞和原代髁突软骨细胞,分别采用M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞条件培养基加入原代髁突软骨细胞培养,利用Western Blot,RT-qPCR等分子生物学方法揭示巨噬细胞影响髁突软骨细胞肥大化的分子机制,为明确创伤性TMJ骨性强直的发病机制提供实验依据。第一部分:建立SD大鼠创伤性颞下颌关节强直模型目的:建立创伤性TMJ强直SD大鼠动物模型并验证强直类型,为明确该疾病的发病机制奠定动物学研究基础。方法:选用60只3周龄雄性SD大鼠并随机分为实验组与对照组。实验组SD大鼠左侧TMJ定义为“手术侧”,行手术模拟TMJ创伤,右侧TMJ定义为“假手术侧”,行假手术。实验组SD大鼠全麻下对颞区和耳前区进行备皮和消毒。在实验组SD大鼠假手术侧做耳前切口,钝性分离至关节间隙,然后分层缝合伤口。实验组SD大鼠手术侧行手术诱导TMJ强直,做1cm长耳前切口,分离并暴露关节囊、关节盘,切除部分关节盘并损伤部分髁突纤维软骨和关节窝,分层缝合伤口。对照组SD大鼠未行手术。在术后1周、术后4周和术后8周测量实验组与对照组SD大鼠的垂直被动最大张口度和下颌侧向开口等。采用大体观察,Micro-CT以及组织学判断SD大鼠是否发生TMJ强直,并确定强直类型。结果:与对照组SD大鼠相比较,实验组SD大鼠在术后1周、术后4周以及术后8周的垂直被动最大张口持续降低,并且下颌侧向开口持续增大。大体观察显示术后8周实验组手术侧TMJ发生融合并增大,关节间隙消失。Micro-CT结果表明,与假手术侧相比,手术侧TMJ发生骨性融合,关节间隙消失并形成了大量钙化骨痂。组织学检查表明,在实验组手术侧TMJ存在软骨内骨化现象。结论:成功建立了SD大鼠创伤性TMJ强直动物模型,确定其强直类型为骨性强直,并初步明确SD大鼠创伤性TMJ骨性强直的发病过程存在软骨骨化。第二部分:巨噬细胞介导的髁突软骨细胞肥大化参与SD大鼠颞下颌关节骨性强直目的:明确巨噬细胞与软骨细胞肥大化在SD大鼠创伤性TMJ骨性强直进展中的作用。方法:设置对照组,将成功建模的SD大鼠在术后1周,术后4周以及术后8周的提取SD大鼠TMJ复合体总RNA,检测RNA浓度并交由华大基因公司完成RNAseq检测,华大基因公司依据BGISEQ-500平台,将测序数据与大鼠参考基因库(NCBI,GCF＿000001895.5＿Rnor＿6.0)比对。分析原始数据并找出关键因子和变化最显著的信号通路,通过RT-qPCR与免疫荧光对RNA-seq检测结果进行验证。结果:RNA-seq共检测到38554个变化的基因,实验组术后1周组与对照组的差异表达基因3453个,实验组术后4周组与对照组的差异表达基因450个,实验组术后8周组与对照组的差异表达基因2939个,找到上述三组共同表达的差异基因,得到25个差异基因。根据GO分析和KEGG分析,发现IL-1β是关键因子,PI3K/AKT信号通路的变化最为显著。软骨细胞肥大化相关因子ALP,Col X,MMP13与RUNX2在术后4周组呈现高表达,免疫荧光检验在术后4周组M1型巨噬细胞标记物CD86呈现高表达。结论:巨噬细胞参与了SD大鼠创伤性TMJ骨性强直发展,初步明确PI3K/AKT是介导SD大鼠创伤性TMJ骨性强直的关键信号通路。第三部分:M1型巨噬细胞旁分泌IL-1β经PI3K/AKT通路调控髁突软骨细胞肥大化目的:明确M1型巨噬细胞通过旁分泌IL-1β经PI3K/AKT通路调控髁突软骨细胞肥大化。方法:选用3周龄雄性SD大鼠,体外分离并培养原代髁突软骨细胞,分别用Ⅱ型胶原免疫组化和阿利新蓝染色鉴定。体外分离培养SD大鼠骨髓来源巨噬细胞,获得原代M0型巨噬细胞并采用流式细胞术鉴定,分别诱导M0型巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞、M2型巨噬细胞,采用RT-qPCR及WB鉴定M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞的表型。获取M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞的条件培养基,加入髁突软骨细胞培养,模拟TMJ强直的微环境,利用RT-qPCR及WB检测PI3K/AKT信号通路的变化,抑制PI3K/AKT通路后,软骨细胞的肥大化相关因子变化。结果:原代大鼠髁突软骨Coll Ⅱ和阿利新蓝着色阳性。M1巨噬细胞促炎标志物IL-1β和i NOS基因及蛋白呈现高表达,M2巨噬细胞抗炎标志物Arg-1和CD206基因及蛋白呈现高表达。M1型巨噬细胞条件培养基与髁突软骨细胞共培养后,PI3K/AKT信号通路被激活,软骨细胞肥大化的相关基因例如ALP,Col X,MMP13和RUNX2显著上调,M2巨噬细胞条件培养基并不能激活PI3K/AKT信号通路,亦不能促使软骨细胞肥大化相关基因表达上调。在M1巨噬细胞条件培养基中加入GIBH-130(IL-1β抑制剂),PI3K/AKT信号通路和软骨细胞肥大化相关基因受到抑制。随后分别抑制PI3K和AKT,均发现软骨细胞肥大化相关基因下调。结论:M1型巨噬细胞通过旁分泌IL-1β,激活PI3K/AKT通路调控髁突软骨细胞肥大化,从而正向调控创伤性TMJ骨性强直。综上所述,本研究采用TMJ复合创伤的办法构建SD大鼠创伤性TMJ强直动物模型,验证模型的可靠性、稳定性,确定SD大鼠创伤性TMJ强直动物模型的强直类型为骨性强直,在TMJ骨性强直中存在软骨骨化。在术后多时间点提取TMJ复合体总RNA,进行RNA-seq测序,初步确定了IL-1β为关键因子,PI3K/AKT是变化最为显著的信号通路。从组织学与体外实验多方面确定了M1型巨噬细胞通过旁分泌IL-1β经PI3K/AKT信号通路介导髁突软骨细胞肥大化,从而加剧SD大鼠创伤性TMJ骨性强直。