1.目的应用体外细胞实验和动物模型实验的方法,从ce RNA角度探讨lncRNA GAS5/miR-21-5p/Sprouty1组合介导系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)肾小球系膜细胞增殖的机制;揭示芪黄健脾滋肾颗粒(Qihuang Jianpi Zishen Granules,QJZ)对MRL/lpr小鼠肾脏损害的疗效及对lncRNA GAS5/miR-21-5p/Sprouty1组合的调控作用,阐明QJZ改善SLE肾损害的分子机制。2.方法2.1研究一:lncRNA GAS5/miR-21-5p/Sprouty1组合调控ERK/CREB通路介导SLE肾小球系膜细胞增殖的机制研究本研究以人肾小球系膜细胞(Human mesangial cells,HMCs)为模型,采用TGF-β1体外刺激HMC;基于基因转染技术,构建基因过表达质粒和小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)进行lncRNA GAS5/miR-21-5p/Sprouty1组合的功能实验;双荧光素酶报告实验验证lncRNA GAS5、miR-21-5p与Sprouty1之间的靶向结合关系;并通过一系列回复实验验证lncRNA GAS5、miR-21-5p与Sprouty1之间的调控关系及对HMC细胞增殖的影响;CCK-8检测HMC细胞活力;FCM检测HMC细胞周期;ELISA检测细胞上清液IL-1、IL-6和TNF-α的含量;RT-q PCR、WB及IF检测lncRNA GAS5/miR-21-5p/Sprouty1组合及ERK/CREB信号通路的表达。2.2研究二:芪黄健脾滋肾颗粒对MRL/lpr小鼠肾脏损害的疗效及对lncRNA GAS5/miR-21-5p/Sprouty1组合的影响本研究以MRL/lpr小鼠为SLE动物模型,40只8周龄雌性MRL/lpr小鼠被随机分为模型组(model)、醋酸泼尼松组(Prednisone,Pred)、芪黄健脾滋肾颗粒组(QJZ)、吗替麦考酚酯组(Mycophenolate mofetil,MMF),每组10只,10只8周龄雌性C57BL/6小鼠为对照组(Conrtol);Pred组小鼠予以Pred治疗;QJZ组小鼠在Pred基础上予以QJZ治疗;MMF组小鼠在Pred基础上予以MMF治疗;连续用药8周后取材检测指标。ELISA检测血清Scr、BUN、细胞因子IL-1、IL-6、TNF-α、抗ds DNA抗体、C3、C4;BCA检测尿蛋白定量;HE和Masson染色观察肾脏病理,并进行活动性指数(activity index,AI)和慢性指数(chronic index,CI)评分;RT-q PCR检测肾组织中lncRNA GAS5、Biotic interactionmiR-21-5p、Sprouty1、ERK1/2和CREB的表达;Western blotting检测Sprouty1、ERK1/2和CREB蛋白的表达。2.3研究三:芪黄健脾滋肾颗粒含药血清通过lncRNA GAS5/miR-21-5p/Sprouty1组合调控ERK/CREB通路抑制SLE肾小球系膜细胞增殖的研究本研究以HMC为模型;制备QJZ含药血清,观察QJZ含药血清对HMC细胞增殖、细胞因子IL-1、IL-6和TNF-α、lncRNA GAS5/miR-21-5p/Sprouty1组合、ERK/CREB通路的影响;通过在干扰表达lncRNA GAS5的基础上,观察QJZ含药血清能否挽救si-GAS5对HMC细胞增殖、细胞因子IL-1、IL-6和TNF-α、lncRNA GAS5/miR-21-5p/Sprouty1组合及ERK/CREB通路的影响,验证QJZ含药血清通过调控lncRNA GAS5/miR-21-5p/Sprouty1组合抑制HMC细胞增殖。3.结果3.1研究一:lncRNA GAS5/miR-21-5p/Sprouty1组合调控ERK/CREB通路介导SLE肾小球系膜细胞增殖的机制研究(1)TGF-β1刺激HMC最佳浓度和时间的筛选:根据CCK-8检测结果,我们选择浓度为10 ng/ml的TGF-β1作用24 h为最佳浓度和时间。(2)lncRNA GAS5、miR-21-5p和Sprouty1在HMC中的表达:RT-q PCR及IF检测结果表明,lncRNA GAS5和Sprouty1在HMC中表达降低(P<0.01),miR-21-5p的表达升高(P<0.01)。(3)lncRNA GAS5、miR-21-5p和Sprouty1在HMC中的转染效率:RT-q PCR检测结果表明,si-GAS5和si-Sprouty1分别转染到HMC后,lncRNA GAS5和Sprouty1ABT-199的表达均下降(P<0.01);3.1-GAS5和3.1-Sprouty1分别转染到HMC后,lncRNA GAS5和Sprouty1的表达均升高(P<0.01);miR-21-5p mimic转染到HMC后,miR-21-5p的表达升高(P<0.01);miR-21-5p inhibitor转染到HMC后,miR-21-5p的表达下降(P<0.01);并且所有NC组均无影响(P>0.05)。(4)lncRNA GAS5、miR-21-5p和Sprouty1的功能实验:lncRNA GAS5过表达后,HMC细胞增殖抑制(P<0.01),ERK/CREB通路活化抑制(P<0.01);miR-21-5p的表达下降(P<0.01),Sprouty1的表达升高(P<0.01);lncRNA GAS5干扰表达后,结果反之。miR-21-5p mimic促进HMC细胞增殖(P<0.01),激活ERK/CREB通路(P<0.01),下调Sprouty1的表达(P<0.01),miR-21-5p inhibitor结果反之。Sprouty1过表达后,HMC细胞增殖抑制(P<0.01),ERK/CREB通路活化抑制(P<0.01);Sprouty1干扰表达后,结果反之。(5)lncRNA GAS5、miR-21-5p、Sprouty1靶向调控关系的验证:双荧光素酶报告实验结果表明,lncRNA GAS5与miR-21-5p之间、miR-21-5p与Sprouty1之间存在结合位点;与NC mimic组相比,miR-21-5p组lncRNA GAS5-wt荧光素酶活性显著降低(P<0.01),而lncRNA GAS5-mut荧光素酶活性无明显变化(P>0.05);与NC mimic相比,miR-21-5p组的Sprouty1-wt荧光素酶活性显著降低(P<0.01),而Sprouty1-mut荧光素酶活性无明显变化(P>0.05);因此,表明lncRNA GAS5、miR-21-5p、Sprouty1三者可以靶向调控,能够形成ce RNA调控关系。(6)回复实验1:在lncRNA GAS5过表达的基础上,再转染si-Sprouty1,结果表明,HMC细胞增殖增加(P<0.01),细胞因子IL-1、IL-6和TNF-α含量升高(P<0.01),ERK/CREB通路活化(P<0.01),si-Sprouty1能逆转lncRNA GAS5过表达的影响。(7)回复实验2:在lncRNA GAS5过表达的基础上,再转染miR-21-5p mimic,结果表明,HMC细胞增殖增加(P<0.01),细胞因子IL-1、IL-6和TNF-α含量升高(P<0.01),ERK/CREB通路活化(P<0.01),miR-21-5p mimic能逆转lncRNA GAS5过表达的影响。3.2研究二:芪黄健脾滋肾颗粒对MRL/lpr小鼠肾脏损害的疗效及对lncRNA GAS5/miR-21-5p/Sprouty1组合的影响(1)QJZ对MRL/lpr小鼠肾脏病理损害的影响:与模型组比较,Pred、QJZ、MMF组小鼠肾脏病CHIR-99021临床试验理AI与CI评分均下降(P<0.01);与Pred组比较,QJZ组AI与CI评分下降(P<0.05);QJZ与MMF组比较,AI与CI评分无明显差异(P>0.05)。(2)QJZ对MRL/lpr小鼠肾功能的影响:与模型组相比,Pred、QJZ与MMF组24h PRO、ACR、Scr及BUN水平均下降(P<0.05);与Pred组比,QJZ组小鼠24h PRO、ACR、Scr水平下降更显著(P<0.01),而BUN下降无明显变化(P>0.05);与MMF组相比,QJZ改善ACR与Scr的作用与MMF相当(P>0.05),而MMF降低24h PRO和BUN的作用更明显(P<0.05)。(3)QJZ对MRL/lpr小鼠细胞因子IL-1、IL-6和TNF-α的影响:与模型组相比,Pred、QJZ及MMF组IL-1、IL-6、TNF-α水平均降低(P<0.01);与Pred组相比,QJZ组IL-1、IL-6、TNF-α水平降低(P<0.01);而QJZ组与MMF组对比,IL-1、IL-6、TNF-α水平无明显差别(P>0.05)。(4)QJZ对MRL/lpr小鼠免疫学指标的影响:与模型组相比,Pred、QJZ及MMF组抗ds DNA抗体水平均下降,C3、C4水平均升高(P<0.01);与Pred组相比,QJZ组抗ds DNA抗体水平降低,C3、C4水平升高(P<0.01);而QJZ组与MMF组相比,抗ds DNA抗体、C3、C4水平无明显差别(P>0.05)。(5)QJZ对MRL/lpr小鼠肾脏GAS5/miR-21-5p/Sprouty1组合的影响:与模型组相比,Pred、QJZ及MMF组GAS5和Sprouty1的表达升高、miR-21-5p的表达下降(P<0.01);与Pred组比较,QJZ组GAS5和Sprouty1的表达升高、miR-21-5p的表达降低(P<0.01)。(6)QJZ对MRL/lpr小鼠肾脏ERK/CREB通路的影响:与模型组相比,Pred、QJZ及MMF组ERK1/2磷酸化水平和CREB磷酸化水平均下降(P<0.01);与Pred组相比,QJZ组ERK/CREB通路磷酸化水平降低(P<0.05)。3.3研究三:芪黄健脾滋肾颗粒含药血清通过lncRNA GAS5/miR-21-5p/Sprouty1组合调控ERK/CREB通路抑制SLE肾小球系膜细胞增殖的研究(1)QJZ含药血清作用于HMC最佳浓度和时间的筛选:CCK-8检测结果表明,QJZ含药血清浓度为10%、作用24 h时抑制HMC细胞活力的作用较好。(2)QJZ含药血清对HMC细胞增殖、细胞因子IL-1、IL-6和TNF-α、ERK/CREB通路、lncRNA GAS5/miR-21-5p/Sprouty1组合的影响:结果表明,QJZ含药血清能够抑制HMC细胞增殖,将细胞增殖阻滞于细胞周期G1期;降低细胞因子IL-1、IL-6和TNF-α的含量(P<0.01);能够上调lncRNA GAS5和Sprouty1的表达(P<0.01),下调miR-21-5p的表达(P<0.01),抑制ERK/CREB通路活化(P<0.01)。(3)QJZ含药血清挽救si-GAS5对HMC细胞增殖、细胞因子IL-1、IL-6和TNF-α、ERK/CREB通路、lncRNA GAS5/miR-21-5p/Sprouty1组合的影响:在转染si-GAS5的基础上,再给予QJZ含药血清干预,结果表明,HMC细胞增殖抑制,细胞因子IL-1、IL-6和TNF-α含量下降(P<0.01)、ERK/CREB通路活化抑制(P<0.01),lncRNA GAS5和Sprouty1的表达升高(P<0.01),miR-21-5p的表达下降(P<0.01),QJZ含药血清能够挽救lncRNA GAS5干扰表达的影响。4.结论(1)lncRNA GAS5/miR-21-5p/Sprouty1组合能够形成ce RNA,lncRNA GAS5竞争性结合miR-21-5p,下调Sprouty1的表达,调控ERK/CREB通路,介导SLE肾小球系膜细胞增殖。(2)芪黄健脾滋肾颗粒能够改善MRL/lpr狼疮小鼠肾脏病理损伤、尿蛋白水平、肾功能指标、血清细胞因子IL-1、IL-6和TNF-α含量以及免疫学指标;能够调控MRL/lpr狼疮小鼠肾脏中lncRNA GAS5/miR-21-5p/Sprouty1组合的表达和ERK/CREB通路的活化。(3)芪黄健脾滋肾颗粒通过lncRNA GAS5/miR-21-5p/Sprouty1组合抑制ERK/CREB通路活化,抑制肾小球系膜细胞增殖,改善SLE肾损害。