目的:动脉粥样硬化可导致大动脉粥样硬化型(Large Artery Atherosclerosis,LAA)脑梗死。动脉粥样硬化病因复杂,确切的分子机制仍不清楚。巨噬细胞是动脉粥样硬化的核心免疫细胞,其数量和表型影响疾病的进展和消退。长链非编码RNA(Long noncoding RNA,lnc RNA)可以通过多种机制调节巨噬细胞表型。双链RNA依赖的蛋白激酶(Double-stranded RNA-dependent protein kinase,PKR)是一种免疫相关的RNA结合蛋白(RNA-binding protein,RBP)。既往研究发现lnc RNA与PKR结合形成复合物,可进一步激活下游通路。我们前期研究在患者中发现lnc＿000048与LAA进展及不良预后相关,但其分子调控机制尚不清楚。因此,我们的研究旨在探索lnc＿000048在巨噬细胞中的功能,验证其是否通过靶向PKR强化JAK1/STAT1通路介导的巨噬细胞极化。方法:采用体外培养人单核细胞(Tohoku Hospital Pediatrics-1,THP-1),给予佛波酯(Phorbol 12-myristate 1CD47-mediated endocytosis3-acetate,PMA)诱导活化24小时后继续用不含PMA培养基培养24小时成为静息状态的巨噬细胞(M0),若进一步用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)/干扰素γ(Interferon-gamma,IFN-γ)刺激48小时则构建经典激活巨噬细胞(M1),并通过实时荧光定量PCR(Real Time Quantitative PCR,RT-q PCR)验证标志物基因(TNF-α、IL-6、IL-1β、CD38、CD80)m RNA的表达和流式细胞术验证表型蛋白(CD11b、CD38、CD80)。通过RT-q PCR检测不同巨噬细胞模型中lnc＿000048的差异表达。通过慢病毒转染构建Sh-lnc＿000048,Sh-NC,Oe-lnc＿000048,Oe-NC转染后的THP-1稳定株,在此基础上构建巨噬细胞极化模型并用流式细胞术、蛋白免疫印迹(Western Blotting,WB)及RT-q PCR验证lnc＿000048对巨噬细胞极化的影响。通过cat RAPID网站预测及RNA-pull down和质谱结合的方法来鉴定并筛选出lnc＿000048的结合蛋白PKR(别名eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 2,EIF2AK2),并使用cat RAPID和RPIseq网站预测lnc＿000048与PKR的结合能力。用lnc Locator在线数据库和原位杂交及免疫荧光对lnc＿000048和PKR进行亚细胞定位。构建M1型巨噬细胞Sh-lnc＿000048-M1组和Sh-NC-M1组,Oe-lnc＿000048-M1组和Oe-NC-M1组,空白对照和JAK抑制剂组,DMSO对照和PKR抑制剂组,PKR抑制剂组+Oelnc＿000048组和PKR抑制剂+Oe-NC组,分别通过蛋白印迹检测STAT1、p-STAT1、PKR、p-PKR蛋白表达水平,Image J分析蛋白相对表达量;流式细胞术分析CD38标记的M1型巨噬细胞含量;RT-q PCR检测M1型巨噬细胞相关极化标志物基因m RNA的表达差异。结果:1.用PMA和LPS/IFN-γ成功构建M0和M1型巨噬细胞模型,lnc＿000048在M1型巨噬细胞中表达量比在M0型高(P<0.05)。2.与Sh-NC组的M1型巨噬细胞相比,Sh-lnc＿000048组的M1型巨噬细胞形态学改变,可见巨噬细胞多为圆形或不规则贴壁状态,伸出的伪足较短;并且Shlnc＿000048会显著抑制M1型巨噬细胞标志物基因TNF-α、IL-6、IL-1β、CD38、CD80的m RNA表达(P<0.05);同时Sh-lnc＿000048也会抑制M1型巨噬细胞分泌性标志物TNF-α和L-1β蛋白的表达(P<0.05),Oe-lnc＿00004selleck抑制剂8后,相应基因的表达升高(P<0.05);流式细胞术结果显示Sh-lnc＿000048后含CD38标记的M1型巨噬细胞减少。3.Sh-lnc＿000048-M1组和Sh-NC-M1组,Oe-lnc＿000048-M1组和Oe-NC-M1组中蛋白印迹结果显示,下调lnc＿000048使STAT1总蛋白表达无明显变化,但pSTAT1蛋白表达量减少;相反,上调lnc＿000048后,p-STAT1蛋白表达相对升高。加入JAK抑制剂后,M1型巨噬细胞总STAT1和p-STAT1表达无明显变化(P>0.05),说明抑制JAK活性不影响总STAT1及磷酸化表达,说明lnc＿000048可强化激活JAK1/STAT1通路介导巨噬细胞向M1型极化。4.通过lnc Locator在线数据库预测lnc＿000048定位于细胞质,通过cat RAPID网站预测及RNA-pull down和质谱结合鉴定lnc＿000048的结合蛋白,筛选免疫相关RNA结合蛋白PKR,并使用cat RAPID和RPIseq网站预测lnc＿000048与PKR的存在结合能力。原位杂交及免疫荧光进行亚细胞共定位lnc＿000048和PKR均在M1型巨噬细胞细胞质。5.分别下调lnc＿000048和加入PKR抑制剂,发现lnc＿000048作为PKR的上游,调控PKR活性;与对照组相比,加入PKR抑制剂后,p-STAT1蛋白表达降低;RT-q PCR结果发现,与未加抑制剂组相比,M1型巨噬细胞分泌性标志物TNF-α、IL-6和IL-1βm RNA的表达量显著下降,CL13900半抑制浓度差异具有统计学意义(P<0.05)。在加入C16组中过表达lnc＿000048,与对照组(Oe-NC)相比,WB结果显示,p-STAT1的表达升高。RT-q PCR结果显示标志物基因TNF-α、IL-6和IL-1βm RNA的表达量也升高。说明上调lnc＿000048可以挽救C16带来的对M1型巨噬细胞极化抑制作用,表明lnc＿000048促进PKR磷酸化,与PKR联合作用强化JAK1/STAT1通路介导的巨噬细胞向M1型极化。结论:1.本研究发现lnc＿000048主要在M1型巨噬细胞中富集,并与PKR共定位于M1型巨噬细胞细胞质。2.Lnc＿000048作为PKR的上游,调控PKR磷酸化激活,来发挥联合作用强化JAK1/STAT1通路介导的巨噬细胞向M1型极化。