随着医学技术的不断发展,种植修复逐渐成为缺牙患者首选的修复方式。钛种植体植入后,其与口腔软硬组织之间能否形成稳定结合是保证种植修复成功的关键。其中,牙龈与种植体颈部基台形成的复合体结构暴露于复杂的口腔有菌环境中,是钛种植体生物表界面的首道屏障结构,对植体骨结合的长期稳定性至关重要。因此,增强“牙龈-基台复合体”表界面生物活性,同时赋予其较强的抗菌性能对促进种植体颈部软组织封闭效果,提升种植成功率具有重要意义。抗菌肽(AMPs)是生物体内特定基因编码的一类具有广谱抗菌活性的小分子蛋白。与抗生素、银离子等传统抗菌剂相比,抗菌肽具有低耐药、低致敏、低毒性等优点,应用前景广泛。其中,LL-37作为唯一人源性Cathelicidin类抗菌肽,除具有抗菌活性外,其在细胞募集、免疫调节、组织愈合等方面也具有重要调节作用,有望成为种植体基台表面功能修饰的理想选择。课题组前期研究中,通过阳极氧化法在钛表面构建出结构规整、高度有序的纳米管阵列,其顶端开口底端封闭的蜂窝形貌,可充当药物的储库,为LL-37加载提供良好的平台。因此,本研究拟借助多巴胺作为中间涂层构建LL-37生物功能化TiO_2纳米管材料,并探究该材料对人牙龈成纤维细胞(HGFs)黏附、迁移和增殖等生物学行为的影响,同时验证其对牙龈卟啉单胞菌(Pg)和变形链球菌(Sm)的抑制作用,以期为种植体颈部材料的优化设计提供新的思路。【目的】借助多巴胺作为中间涂层,将抗菌肽LL-37加载至具有纳米管阵列的光滑钛表面,构建LL-37生物功能化TiO_2纳米管钛材;探究LL-37生物功能化TiO_2纳米管钛材对HGFs黏附、迁移、增殖等生物学行为的影响;验证LL-37生物功能化TiO_2纳米管钛材对牙龈卟啉单胞菌及变形链球菌的抗菌作用。【方法】第一部分LL-37生物功Alisertib体内能化TiO_2纳米管材料的制备和表征采用阳极氧化法在光滑钛(Polished Ti,P)表面构建TiO_2纳米管阵列(Nanotube,NT),之后借助多巴胺作为中间涂层(dopamine@NT,PD@NT)在TiO_2纳米管表面负载不同浓度(25μg/m L和100μg/m L)的抗菌肽LL-37,分别标记为LL-37-PD@NT(25)和LL-37-PD@NT(100)。利用场发射扫描电镜(SEM)、原子力显微镜(AFM)、X射线光电子能谱仪(XPS)及接触角测量仪等设备对各组钛试样进行表征,观察其表面形貌、粗糙度、元素组成及亲水性能。通过FITC荧光标记实验及酶标仪检测明确抗菌肽LL-37的加载水平及释放特点。第二部分LL-37生物功能化TiO_2纳米管材料对HGFs生物学行为的影响将HGFs接种于各组钛试样表面,利用细胞免疫荧光染色、激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)及SEM观察HGFs的黏附数量及生长形态;通过划痕实验和Transwell迁移实验观察HGFs的迁移变化;借助MTT检测观察HGFs细胞增殖水平,以充分评价LL-37-PD@NT材料的生物活性。第三部分LL-37生物功能化TiO_2纳米管材料的抗菌性能检测将牙龈卟啉单胞菌(Pg)和变形链球菌(Sm)分别接种于各组钛试样表面,利用平板涂布检测细菌黏附数量,通过SEM观察细菌形态及菌体间连接水平,借助细菌活死染色检测细菌活力并计算活/死菌比例,以充分评价LL-37-PD@NT材料的抗菌性能。【结果】第一部分LL-37生物功能化TiO_2纳米管材料的制备和表征1、SEM观察可见P组材料表面光滑无划痕,NT组材料表面有均匀排列的管径约为80-100 nm的管状结构,PD@NT组材料表面也有同NT组表面的管状结构,但管壁变厚,管径显著变小,LL-37-PD@NT(25)和LL-37-PD@NT(100)组材料表面形貌与PD@NT组无显著差异。2、各组试样接触角测量结果:P组>LL-37-PD@NT组>PD@NT组>NT组;各组试样AFM测量结果:NT组、PD@NT组、LL-37PD@NT组的表面粗糙度均大于P组。3、XPS结果中PD@NT组Ti峰消失,N峰、C-N峰出现均提示多巴胺涂层的成功构建;LL-37PD@NT组N峰增强,N元素含量升高,C-N、C=O峰增强均提示LL-37成功加载4、荧光标记抗菌肽后加载试验结果表示LL-37-PD@NT(100)组试样表面荧光强度较LL-37-PD@NT(25)组升高,提示随着浸泡浓度的增加,试样表面抗菌肽负载量增加。5、体外释放实验结果显示,抗菌肽表现为早期的突释(1-24 h)和长期(2-8 d)的缓释过程,LL-37-PD@NT(25)和LL-37-PD@NT(100)组试样表面抗菌肽累积释放量在24 h时可分别达到达到3.6μg和8.8μg,并且在8 d后仍可检测到抗菌肽的释放。第二部分LL-37生物功能化TiO_2纳米管材料对HGFs生物学行为的影响1、利用细胞免疫荧光对各组HGFs细胞核进行染色,CLSM观察结果显示,与P组相比,NT组HGFs早期黏附数量显著下降,而PD@NT、LL-37-PD@NT(25)和LL-37-PD@NT(100)组黏附数量增加,在2 h时尤为显著。通过SEM观察HGFs形态,发现接种4 h时PD@NT、LL-37-PD@NT(25)和LL-37-PD@NT(100)组细胞铺展面积较P组显著变大,并伸出细长伪足。利用细胞免疫荧光对各组HGFs细胞骨架蛋白进行染色,CLSM观察结果显示,接种24 h时LL-37-PD@NT(25)和LL-37-PD@NT(100)组HGFs细胞长短径比显著增加,相较于其他各组,HGFs有两极伸展趋势。2、划痕实验结果显示,LL-37-PD@NT(25)组HGFs迁出的数量最多,划痕关闭时间最短。Transwell迁移实验结果显示,LL-37-PD@NT(100)组迁移至下室的HGFs数量Antibiotic kinase inhibitors最多。3、MTT实验结果显示,相较于P组,NT组HGFs增殖能力显著降低,而PD@NT、LL-37-PD@NT(25)和LL-37-PD@NT(100)组HGFs增殖能力显著升高,其中,PD@NT、LL-37-PD@NT(25)和LL-37-PD@NT(100)组HGFs增殖能力无显著差异。第三部分LL-37生物功能化TiO_2纳米管抗菌性能检测1、平板计数结果显示,各组材料表面牙龈卟啉单胞菌及变形链球菌的菌落形成数量顺序为:P组>NT组>PD@NT组>LL-37-PD@NT(25)组>LL-37-PD@NT(100)组。2、SEM观察可见,相较于P、NT和PD@NT组,LL-37-PD@NT(25)和LL-37-PD@NT(100)组牙龈卟啉单胞菌及变形链球菌的形态发生明显改变,菌膜皱缩,菌体轮廓塌陷,细菌间连接稀疏,尤其是LL-37-PD@NT(100)组,细菌甚至发生破裂。3、活死细菌染色结果显示,相较于P、NT和PD@NT组,LL-37-PD@NT(25)和LL-37-PD@NT(100)两组试样表面黏附活菌数量显著下降,LL-37-PD@NT(100)组试样表面活/死菌比例为各组最低。【结论】借助多巴胺涂层可成功将抗菌肽LL-37加载至具有多孔纳米形貌的钛NVP-TNKS656分子式材表面,所构建的LL-37生物功能化TiO_2纳米管材料不仅具有良好的生物活性,促进HGFs早期黏附、迁移及增殖,同时对牙龈卟啉单胞菌和变形链球菌具有较强抑制作用,有利于增强种植体颈部软组织封闭效果,为“牙龈-基台复合体”生物表界面材料的优化设计提供新思路。