目的:本研究通过动物体内实验和体外细胞实验,利用含不同游离二氧化硅的煤尘和mi RNA let-7c inhibitor进行干预,探讨let-7c调控巨噬细胞极化诱导肺上皮间质转化在大鼠煤工尘肺(Coal workers pneumoconiosis,CWP)发病中的作用。方法:1.动物实验:对8W大鼠进行气管滴注染尘,实验分组为:空白对照组、煤尘组(游离二氧化硅含量5%)、煤矽尘组(游离二氧化硅含量30%)、矽尘组(游离二氧化硅含量99.9%),于干预1、3月时间点提取巨噬细胞和肺组织,使用Masson染色和HE染色观察肺组织纤维化程度;使用免疫荧光检测巨噬细胞极化;使用Western blotting检测TGFβ-1、波形蛋白、E-钙粘连蛋白表达水平;使用PCR检测Let-7c、c/EBP-δ表达水平。2.细胞实验:体外培养NR8383大鼠肺泡巨噬细胞,NR8383在M1型极化环境(100ng/m L LPS)以及M2型极化环境(20ng/m L IL-4)分别诱导向M1型和M2型极化,实验分组为:对照组、煤矽尘组、LPS+煤矽尘组和IL-4+煤矽尘组,使用PCR检测Let-7c、c/EBP-δ表达水平。将mi RNA let-7c inhibitor转染入NR8383细胞,抑制let-7c的表达,实验分组为:对照组、IL-4组、IL-4+煤矽尘组、Let-7c抑制剂组、IL-4+煤矽尘+Let-7c抑制剂组,使用免疫荧光检测巨噬细胞极化情况,将NR8383细胞和RLE-6TN细胞Transwell共培养,按照上述分组处理后,使用PCR检测NR8383细胞中Let-7c、c/EBP-δ表达水平,使用Western blotting检测NR8383细胞中TGFβ-1表达水平和RLE-6TN细胞中E-钙粘连蛋白、波形蛋白表达水平。结果:1.动物实验(1)煤尘对大鼠肺组织形态的影响,实验组大鼠的肺组织形态与对照组差异明显,对照组肺表面光滑,呈粉红色,质软;煤尘组肺表面可看见明显的黑斑,有的遍布整个肺叶,质软色黑;煤矽组肺表面有明显的“煤矽结节”,结节较大,呈圆形、不规则形,质较硬;矽尘组可看见大片白色结节。(2)煤尘对大鼠肺组织纤维化的影响,HE染色中,染尘一个月时(1M),对照组大鼠肺组织结构清晰,肺泡壁完整,煤尘组、煤矽尘组有煤斑生成,矽尘组的肺泡壁增厚;染尘三个月时(3M),煤尘组、煤矽尘组有煤斑生成,且矽尘组有矽结节形成。Masson染色中,1M时间点,对照组大鼠肺组织结构清晰,肺泡中无蓝色纤维化病变,煤尘组、煤矽尘组明显可以看到煤斑周围有蓝色纤维围绕,矽尘组的蓝色纤维较多;3M时间点,煤尘组、煤矽尘组煤斑周围蓝色纤维较一月增加更较明显,且矽尘组有矽结节形成。(3)煤尘对大鼠肺泡巨噬细胞极化的影响,免疫荧光结果显示:处理和时间对Infection rateCD86存在明显的交互作用(P<0.05),与对照组相比,在1 M时间点,煤尘组、煤矽尘组和矽尘组CD86的表达量逐渐增加(P<0.05),在3 M时间点的表达量逐渐减少(P<0.05)。处理和时间对CD206存在明显的交互作用(P<0.05),与对照组相比,煤尘组、煤矽尘组和矽尘组CD206在1M时间点和3M时间点的表达量均逐渐升高,尤其在煤矽尘组和硅尘组(P<0.05)。进一步分析CD206与CD86的比值(CD206/CD86),CD206/CD86在1M时间点和3M时间点均呈现上升的趋势(P<0.05)。(4)煤尘对大鼠肺组织EMT的影响,Western blot检测结果显示:处理和时间对TGF-β1和波形蛋白的表达有明显的交互作用(P<0.05)。1M时间点,与对照组相比,煤尘组和煤矽尘组的TGF-β1蛋白表达水平无明显变化(P>0.05),矽尘组显著升高(P<0.05);与对照组相比,煤尘组、煤矽尘组与矽尘组E-钙粘连蛋白表达水平均显著降低(P<0.05);与对照组相比,煤尘组、煤矽尘组与矽尘组波形蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。3M时间点,与对照组相比,煤尘组、煤矽尘组和矽尘组的TGF-β1蛋白表均显著升高(P<0.05);与对照组相比,煤尘组、煤矽尘组与矽尘组E-钙粘连蛋白表达水平均显著降低(P<0.05);与对照组相比,煤尘组、煤矽尘组和矽尘组的波形蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。(5)煤尘对大鼠肺泡巨噬细胞let-7c、c/EBP-δ的影响,PCR检测结果显示:处理和时间对let-7c和c/EBP-δ的表达有明显的交互作用(P<0.05)。1M时间点,与对照组相比,煤尘组和煤矽尘组的let-7c表达水平无明显变化(P>0.05),矽尘组显著升高(P<0.05);与对照组相比,煤尘组、煤矽尘组与矽尘组c/EBP-δ表达水平均显著降低(P<0.05);3M时间点,与对照组相比,煤尘组、煤矽尘组和矽尘组的let-7c表达水平均显著升高(P<0.05);与对照组相比,煤尘组、煤矽尘和矽尘组c/EBP-δ表达水平均显著降低(P<0.05)。2.细胞实验(1)煤矽尘对NR8383细胞中let-7c、c/EBP-δ表达的影响,PCR检测结果显示:与对照组相比,煤矽尘组和LPS+coal silica组let-7c表达量无明显变化(P>0.05),IL-4+coal silica组的let-7c表达量增加(P<0.05)。与对照组相比,煤矽尘组和LPS+coal silica组c/EBP-δ的表达无明显变化(P>0.05),IL-4+coal silica组c/EBP-δ的获悉更多表达下降(P<0.05)。(2)let-7c inhibitor转染入Nwww.selleck.cn/products/smoothened-agonist-sag-hclR8383细胞后,let-7c对煤矽尘作用后的对NR8383细胞中let-7c、c/EBP-δ表达的影响,与对照组相比,IL-4组和IL-4+煤矽尘组的let-7c表达量逐渐增加(P<0.05),而let-7c抑制剂组,IL-4+煤矽尘组+let-7c抑制剂组let-7c表达均下降(P<0.05),但相对于let-7c抑制剂组,IL-4+煤矽尘组+let-7c抑制剂组表达增加(P<0.05)。与对照组相比,IL-4组和IL-4+煤矽尘组c/EBP-δ的表达量逐渐降低(P<0.05),而let-7c抑制剂组,IL-4+煤矽尘组+let-7c抑制剂组c/EBP-δ表达均增加(P<0.05),但相对于let-7c抑制剂组,IL-4+煤矽尘组+let-7c抑制剂组表达增加(P<0.05)。(3)let-7c对煤矽尘作用后的NR8383细胞极化的影响,免疫荧光结果显示:与对照组相比,IL-4组和IL-4+煤矽尘组的CD206表达量逐渐增加(P<0.05),而let-7c抑制剂组,IL-4+煤矽尘组+let-7c抑制剂组CD206表达量均下降(P<0.05),但相对于let-7c抑制剂组,IL-4+煤矽尘组+let-7c抑制剂CD206表达增加(P<0.05)。与对照组相比,IL-4组、IL-4+煤矽尘组、let-7c抑制剂组和IL-4+煤矽尘组+let-7c抑制剂组CD86的表达无明显变化(P>0.05)。(4)let-7c对煤矽尘作用后的NR8383细胞中TGF-β1和RLE-6NT细胞中E-钙粘连蛋白、波形蛋白表达的影响,Western blot检测结果显示:与对照组相比,IL-4组和IL-4+煤矽尘组TGF-β1和波形蛋白的表达量逐渐增加(P<0.05),而let-7c抑制剂组,IL-4+煤矽尘组+let-7c抑制剂组的TGF-β1和波形蛋白表达量均下降(P<0.05),但相对于let-7c抑制剂组,IL-4+煤矽尘组+let-7c抑制剂组增加(P<0.05);与对照组相比,IL-4组和IL-4+煤矽尘组的E-钙粘连蛋白表达量逐渐降低,而let-7c抑制剂组,IL-4+煤矽尘组+let-7c抑制剂组的E-钙粘连蛋白表达量均升高,但相对于let-7c抑制剂组,IL-4+煤矽尘组+let-7c抑制剂组降低(P<0.05)。结论:1、煤尘可促进大鼠肺纤维化,促进CWP进展;2、煤尘可通过影响巨噬细胞极化,进而影响TGF-β1、E-钙粘连蛋白、波形蛋白表达;3、Let-7c可通过调节巨噬细胞极化促进上皮间质转化,从而参与肺纤维化的形成。