粗甘油作为生物柴油工业中的主要副产物之一,其能够通过微生物直接发酵为高值化学品1,3-丙二醇,是其绿色高值化利用的有效途径。受粗甘油复杂成分的影响,微生物转化发酵的效率并不高。其中,甘油代谢合成1,3-丙二醇途径中的关键酶活性受到粗甘油杂质的点击此处严重抑制,是导致其发酵粗甘油产1,3-丙二醇效率过低的主要原因之一。甘油脱水酶被认为是甘油代谢产1,3-丙二醇途径中的关键限速酶,其活性对1,3-丙二醇合成速率和产率起决定作用。通过开展耐受粗甘油的甘油脱水酶资源的发掘与研究,将为应用于粗甘油转化的工程菌株开发提供重要的理论依据。课题组前期研究结果表明,一株高产1,3-丙二醇的菌株Klebsiella pneumoniae 2 e在以粗甘油为底物发酵过程中,其甘油脱水酶酶活几乎不受粗甘油环境的影响,具有突出的粗甘油杂质耐受特性,极具研究价值与应用前景。本文以K.pneumoniae 2e的甘油脱水酶(2eGDHt)为研究对象,对其编码序列、酶学性质、粗甘油耐受特性及功能结构稳定性等开展了深入探究,取得的研究结果如下:1.采用生物信息学方法分析了 2eGDHt编码序列并构建了其蛋白质三维结构模型。分析结果表明2eGDHt由α、β与γ三个亚基组成,属于辅酶B12依赖型甘油脱水酶,与其他K.pneumoniae菌属的甘油脱水酶序列具有较高的保守性,但与其他甘油脱水酶在744位缬氨酸不同,其为异亮氨酸。AlphaFold2三维结构建模分析表明其结构为异源六聚体,与PDB数据库中来自于K.pneumorenal pathologyniae菌甘油脱水酶(PDB id:1IWP)晶体结构具有高度相似性,但2eGDHt结构中含有更多的无规则卷曲结构与更少的β-折叠等二级结构。2.表达纯化出重组2eGDHt并探究了其酶学理化性质与粗甘油杂质耐受特性。在大肠杆菌中成功表达出重组2eGDHt。酶学理化性质分析结果表明,2eGDHt最适底物为1,2-丙二醇,最适反应温度和pH分别为37℃和7.0,其温度和pH耐受范围分别为35-40℃和6.0-9.0。多种金属离子对其酶活均有不同程度的抑制作用,其中二价钙离子对酶活抑制作用最强,抑制其40%酶活。不同化学抑制剂对其酶活有不同程度的抑制作用,其中十二烷基磺酸钠对其酶活的抑制作用最大,可抑制其47.4%的酶活。粗甘油杂质影响实验结果表明低浓度的氯化钠、甲醇、油酸与亚油酸等粗甘油主要杂质对其酶活几乎无抑制作用。同时,在上述杂质混合模拟粗甘油环境条件下,其酶活基本不受影响。这些结果表明2eGDHt具有较强的粗甘油耐受特性。3.解析了 2eGDHt与粗甘油杂质耐受特性相关的关键功能结构位点。分子动力学模拟均方根波动RMSD表明氯化钠和亚油酸是影响2eGDHt稳定性的关键因素,粗甘油环境对2eGDHt的稳定性有一定影响。多序列比对和分子动力学模拟分析均方根浮动RMSF的结果表明,2eGDHt蛋白结构一段特有的卷曲结构的740-747位残基对其维持在粗甘油杂质环境中的灵活性具有重要作用。定点突变结合突变能预测结果表明,Ile744Val(I744V)突变对该酶的整体稳定性基本无影响。定点突变与酶学实验分析结果表明突变体在粗甘油底物的环境下酶活显著降低,而在纯甘油底物的环境下酶活并无明显变化,I744V的RMSD和RMSF表明该突变体具有更好的稳定性与蛋白刚性,这些结果表明Ile744是2eGDHPLX5622半抑制浓度t与粗甘油杂质耐受特性相关的关键功能结构位点。4.探究了维持2eGDHt蛋白结构稳定性的关键残基及其影响。通过生物信息学P DBePISA程序结合结构生物学分析结果表明262个氨基酸位点对其异源六聚体结构的维持起支持作用。通过统计学的方法,结合Discovery Studio、Imutant2.0和Mupr o软件预测定点突变后前后的突变能变化,筛选相关的突变点进行突变候选。点突变实验与酶学分析结果进一步显示315位的ARG(R)突变为PRO(P)后对其结构影响最大。进一步的分子动力学模拟分析表明,与WT相比,315位的R突变后,其稳定性、灵活性、结构紧致程度、溶剂可及表面积与氢键成键数量等都有不同程度的下降。这些实验表明2eGDHt的315位R氨基酸是维持2eGDHt蛋白结构稳定性的关键氨基酸。本研究通过对具有粗甘油杂质耐受特性的2eGDHt开展了深入研究,采用生物信息学方法分析了 2eGDHt编码序列并构建了其蛋白质三维结构模型;表达纯化出重组2eGDHt并探究了其酶学理化性质与粗甘油杂质耐受特性;解析了 2eGDHt与粗甘油杂质耐受特性相关的关键功能结构位点;探究了维持2eGDHt蛋白结构稳定性的关键残基及其影响。本研究结果将为应用于粗甘油转化发酵的工程菌株开发具有重要意义提供理论依据。