研究背景和意义视网膜是代谢高度活跃的组织,需要消耗大量的氧气和营养。这些氧气和营养由血管负责输送,因此,血管系统的正常发育对于构建具有视觉功能PUN30119体外的神经视网膜至关重要。视网膜血管网络的形成受到机体精细的调节,需要不同类型的细胞相互作用,其中,星形胶质细胞扮演着举足轻重的角色。血管内皮细胞在多种因子和信号途径的刺激下增殖并形成血管,这一过程在生理、病理条件下都十分重要。异常的血管生成会破坏氧气和营养的输送,导致代谢失衡以及神经视网膜功能损害,与多种视网膜新生血管性眼病有关,如早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity,ROP)、增殖性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR)等。与视网膜内正常的血管不同,这些异常的新生血管不仅更加脆弱,也更容易出血、引起渗漏。在这类眼部疾病中,血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)水平会大幅度升高。既往研究证实,VEGFA是生理和病理状态下血管生成过程中的关键调节因子,而星形胶质细胞是视网膜生理、病理条件下VEGFA的主要来源。目前,以VEGFA为靶标的药物玻璃体腔注射已成为临床治疗上述视网膜新生血管性眼病的常用手段和一线疗法,并且取得了不错的治疗效果。然而,多次注射带来的经济压力、可能的严重并发症以及部分患者的低反应性也不容忽视。因此,了解视网膜生理和病理情况下血管的形成过程、寻找更佳的替代治疗策略仍是目前眼科学研究中的重要基础和临床课题。Irisin是2012年在骨骼肌细胞中被发现的一种肌动因子,在骨骼、脂肪等组织中通过与整合素受体结合发挥作用。早期研究发现,irisin具有诱导白色脂肪组织褐变以及调节能量、葡萄糖和脂肪酸等代谢的功能。随着研究的不断深入,irisin被发现在不同系统和脏器均有表达,并且在肝、肺、心脏、肠道等脏器缺血再灌注损伤时能发挥保护作用,主要通过减少氧化应激、抑制细胞凋亡、减轻炎症、维持内皮细胞间屏障等。而ROP、PDR等也被认为是由缺血引发视网膜内一系列反应,最终导致血管新生的一类眼病。近期研究中发现,PDR患者的玻璃体液和血清中irisin含量明显比非增殖性糖尿病视网膜病变(non-proliferative diabetic retinopathy,NPDR)患者Preformed Metal Crown和对照组低,提示irisin在视网膜病理性血管生成过程中可能有着一定的作用。然而,irisin在正常血管形成过程中是否有表达,血管生成异常时表达是否会发生变化,在病理性血管生成过程中有什么作用都尚不清楚,需要我们进行进一步的探索和明确。立足文献综述和调研,结合前期的工作基础,本课题从体内体外、动物细胞层面,采用视网膜铺片、免疫印迹、q RT-PCR、冰冻切片、免疫荧光等技术,选取不同天龄小鼠,构建氧诱导视网膜病变(oxygen induced retinopathy,OIR)和新生氧诱导视网膜病变(neonatal oxygen induced retinopathy,NOIR)两种小鼠模型,在观察视网膜血管发育过程和该过程中irisin表达变化的基础上,探究irisin在视网膜病理性新生血管形成过程中的变化、作用及机制,以期为视网膜新生血管性眼病的基础研究以及临床治疗提供新思路和可能的干预策略。目的:观察视网膜血管的发育过程以及该过程中irisin的表达变化,明确irisin在小鼠氧诱导视网膜病变中的表达和作用,探究irisin在病理性血管新生过程中的作用机制。方法:一、动物实验1.取出生后(postnatal,P)1、4、7、12、14、17天的C57BL/6小鼠,视网膜铺片观察血管和其生长骨架星形胶质细胞离心状迁移的变化;同样天龄的小鼠,做眼球冰冻切片,荧光染色观察血管在视网膜不同层间的生长情况。2.提取P1、P4、P7、P12、P14、P17的C57BL/6小鼠视网膜蛋白,western blot检测irisin的表达,并通过冰冻切片荧光染色观察其定位。3.建立C57BL/6小鼠OIR模型,western blot检测OIR小鼠模型P14、P17时视网膜中irisin和VEGFA表达变化,免疫荧光染色观察相应时间点irisin和VEGFA的定位。4.给OIR小鼠外源性补充irisin蛋白,P17时视网膜铺片IB4、CD31染色观察视网膜病理性血管新生情况;提取相应时间点的视网膜蛋白,western blot检测细胞增殖标志蛋白PCNA和VEGFA蛋白表达;视网膜冰冻切片,TUNEL染色观察细胞凋亡;提取相应时间点视网膜总RNA,检测血管和炎症相关因子TNF-α、IL-1β和MCP-1基因表达。5.建立C57BL/6小鼠NOIR模型,外源性补充irisin蛋白,P7时视网膜铺片IB4、PDGFRα染色观察视网膜血管和星形胶质细胞迁移情况,免疫荧光染色观察细胞增殖标志蛋白PH3表达,western blot检测PDGFRα、VEGFA蛋白表达。二、细胞实验1.原代培养视网膜星形胶质细胞,诱导化学缺氧损伤模型。ELISA检测缺氧损伤后培养基中VEGFA含量,q RT-PCR、western blot检测细胞中VEGFA表达。2.在缺氧损伤的星形胶质细胞中加入irisin作用24小时,ELISA检测培养基中VEGFA含量,q RT-PCR、western blot检测细胞中VEGFA表达。3.收集各组星形胶质细胞条件培养基,与新鲜培养基1:1混合后,用来处理人微血管内皮细胞(human microvascular endothelial cells 1,HMECs-1),transwell、管腔形成实验观察各组星形胶质细胞条件培养基对HMECs-1迁移、血管生成能力的影响。4.在缺氧损伤的星形胶质细胞中分别加入PBS(溶剂)、irisin、irisin+整合素抑制剂、整合素抑制剂,ELISA检测培养基中VEGFA含量,western blot检测星形胶质细胞中VEGFA、HIF-1α和HIF-2α的蛋白表达。结果:一、动物实验1.在小鼠视网膜发育过程中,血管的发生开始于星形胶质细胞进入视网膜之后,从中心向周边视网膜迁移,在P7时几乎铺满视网膜。此时,形成的浅层血管丛分布于神经纤维层。Irisin的表达自出生后逐渐增多,在P7前仅定位于神经纤维层,在P14时表达量达峰值。2.P14、P17时OIR小鼠视网膜内irisin m RNA和蛋白水平与常氧组相比显著下降,VEGFA m RNA和蛋白水平与常氧组相比明显增多。3.外源性补充irisin蛋白,显著减少OIR小鼠视网膜新生血管区和无血管区面积。此外,irisin还可以抑制OIR小鼠视网膜神经元细胞凋亡,下调TNF-α、IL-1β和MCP-1基因表达;OIR小鼠视网膜中PCNA、VEGFA蛋白表达较对照生理盐水组显著下降。4.外源性补充irisin蛋白能显著减少NOIR小鼠视网膜血管Y-27632试剂化面积和单位面积内皮细胞增殖数目,降低血管密度和长度。二、细胞实验1.体外培养的视网膜星形胶质细胞化学缺氧损伤后,培养基中VEGFA含量显著升高,细胞中VEGFA m RNA和蛋白表达水平上调。2.Irisin抑制缺氧导致的视网膜星形胶质细胞VEGFA上调;同时,irisin处理后的星形胶质细胞条件培养基,相比对照组星形胶质细胞条件培养基,显著抑制HMECs-1的迁移和管腔形成,并且这一抑制作用可以被外源性补充VEGFA部分逆转。3.整合素抑制剂可以抑制irisin导致的视网膜星形胶质细胞中VEGFA、HIF-1α和HIF-2α蛋白水平下降。结论:本研究首次观察了irisin在小鼠视网膜血管发育过程中的表达及在OIR中的变化,证实irisin可以通过抑制星形胶质细胞VEGFA表达减轻小鼠视网膜病理性新生血管形成。在体实验检测了视网膜血管发育过程和OIR中irisin的变化,通过OIR和NOIR小鼠模型明确了irisin对病理性血管新生的负性调控作用,并且该作用可能与星形胶质细胞有关。继而,通过体外实验培养视网膜星形胶质细胞,重点观察irisin对缺氧损伤的视网膜星形胶质细胞VEGFA表达的影响,提出irisin通过整合素受体抑制HIF-1α、HIF-2α,下调VEGFA水平,从而抑制血管内皮细胞迁移和管腔形成。本研究不仅首次揭示了视网膜血管正常发育和异常生长时irisin的变化,而且探索了irisin在氧诱导视网膜病变中的作用和机制,深化了对irisin的分子功能以及视网膜新生血管性眼病的认识,并将为拓展此类疾病的临床治疗提供新思路和实验依据。