研究目的通过筛选ox-LDL最适浓度制造钙化模型,验证IL-37干预对钙化模型的影响,研究IL-37对于人主动脉血管平滑肌细胞(HA-SMCs)的作用及其机制,为血管钙化(VC)及动脉粥样硬化(AS)寻找新的治疗靶点提供理论依据。研究方法1.筛选诱导FUT-175HA-SMCs钙化的最佳浓度:体外培养HA-SMCs,分为空白组、(10、25、50、100)μg/m L处理ox-LDL组,cck8法检测细胞增殖活性,qpcr和ELISA、WB分别检测平滑肌肌动蛋白(SMA)、平滑肌22α(SM22α)、骨形态发生蛋白(BMP2)、runx相关转录因子(RUNX2)、OC、碱性磷酸酶(ALP)、IL-37的表达,筛选出(50μg/m L)ox-LDL造模浓度,茜素红钙化染色验证模型成立。2.将HA-SMCs分为对照组、ox-LDL处理组、IL-37(2h)+ox-LDL处理组,饥饿24小时后,对照组换完全培养基,处理组换钙化培养基(10mmol/Lβ-甘油磷酸+50μg/m L L-抗坏血酸+100nmol/L地塞米松),诱导细胞3天、14天后,qpcr和WB检测TLR4、NF-κB、成骨相关因子MSX2、ALP、RUNX2的表达,cck8检测细胞增殖率,流式术检测细胞凋亡率,茜素红染色验证细胞钙化程度。3.将HA-SMCs分为对照组、ox-LDL处理组、IL-37(2h)+ox-LDL处理组、NF-κB抑制剂PDTC(2h)+ox-LDL处理组,传代后饥饿细胞24h,对照组更换完全培养基、处理组换钙化培养基,(10mmol/Lβ-甘油磷酸+50μg/m L L-抗坏血酸+100nmol/L地塞米松),qpcr、western blot检测TLR、NF-κB、磷酸化核转录因子(p-NF-κB)、RUNX2、MSX2、ALP、SMA、SM22α的表达水平。研究结果1.采用梯度浓度的ox-LDL(10、25、50、100μg/m L)处理HA-SMCs 3天,WB结果显示,50μg/m L ox-LDL处理组中IL-37的表达量最高,qpcr结果显示:梯度浓度ox-LDL处理细胞1天、7天、14天后,与对照组相比,SMA、SM22α的表达明显下降,其中50μg/m L ox-LDL处理组表达量最低,差异具有统计学意义。因此选择50μg/m L的ox-LDL作为造模干预浓度。Qupper extremity infectionspcr结果显示,与对照组相比,50μg/m L浓度ox-LDL处理细胞3天后,BMP2、RUNX2的表达量较对照组相比明显升高。ELISA结果显示,50μg/m L浓度ox-LDL处理细胞后3天,上清液中的IL-37表达有所升高。ALP试剂盒检测上清液中的ALP活性,提示ox-LDL处理组上清液中ALP活性下降,差异具有统计学意义。2.将HA-SMCs分为对照组及钙化造模组,传代后的细胞饥饿24小时后,对照组换完全培养基,造模组换钙化培养基(10mmol/Lβ-甘油磷酸+50μg/m L L-抗坏血酸+100nmol/L地塞米松)并加入50μg/m L浓度的ox-LDL诱导细胞14天,茜素红s染色结果显示,钙化造模组较对照组出现明显的橘红色钙化结节,钙化模型建立成功。qpcr、ELISA及WBEnasidenib供应商结果提示,钙化造模组IL-37在细胞内外的表达量较对照组均有明显升高,造模组成骨相关因子表达也同样升高。3.将HA-SMCs分为对照组、ox-LDL处理组、IL-37(2h)+ox-LDL处理组,饥饿24小时后,对照组换完全培养基,处理组换钙化培养基(10mmol/Lβ-甘油磷酸+50μg/m L L-抗坏血酸+100nmol/L地塞米松),诱导细胞3天后,qpcr结果显示,与对照组相比,ox-LDL处理组TLR4、NF-κB、RUNX2、MSX2、ALP的表达明显升高;与ox-LDL处理组相比,IL-37(2h)+ox-LDL处理组NF-κB、RUNX2、MSX2、ALP明显降低,同时较对照组更低。WB结果显示与对照组相比,ox-LDL处理组NF-κB表达明显升高,TLR2、RUNX2同时也升高,加入IL-37处理后,相应因子表达下降。4.茜素红染色示ox-LDL处理组钙化结节较对照组相比明显增多,而加入IL-37处理后,与ox-LDL处理组相比,IL-37(2h)+ox-LDL处理组结节数量明显减少。明确了IL-37对HA-SMCs的保护作用,增加IL-37的预处理,能够明显减少钙化结节的形成。与空白组相比、(10、25、50、100)μg/m L ox-LDL处理后,50μg/m L浓度ox-LDL组SMA表达量最低,BMP2呈高表达,差异具有统计学意义。与对照组相比,造模组IL-37高表达。(10、25、50、100)μg/m L ox-LDL处理后,细胞增殖活性明显升高,且呈浓度及时间依赖,50μg/m L ox-LDL组中加入100ng/m LIL-37预处理,细胞增殖活性被抑制。5.将HA-SMCs分为对照组、ox-LDL处理组、NF-κB抑制剂PDTC(2h)+ox-LDL处理组,传代后饥饿细胞24h,对照组更换完全培养基、处理组换钙化培养基,(10mmol/Lβ-甘油磷酸+50μg/m L L-抗坏血酸+100nmol/L地塞米松)。处理3天后,qpcr结果显示,与对照组相比,ox-LDL处理组成骨转录相关因子RUNX2、ALP、MSX2、OC明显升高。与ox-LDL处理组相比,NF-κB抑制剂PDTC(2h)+ox-LDL处理组中NF-κB明显被抑制,RUNX2的表达有所下降。WB结果显示相应蛋白表达与PCR结果的RNA表达趋势一致。证实炎症因子水平降低时,成骨相关因子的表达会被抑制,二者具有相关性。6.将HA-SMCs分为对照组、梯度浓度ox-LDL处理组(10、25、50、100μg/m L)、IL-37(2h)+ox-LDL处理组,Western blot检测磷酸化NF-κB的表达,结果显示,梯度浓度ox-LDL处理后,NF-κB的磷酸化水平呈浓度依赖性升高,50μg/m L时,磷酸化程度最强,增加IL-37预处理之后,磷酸化水平被抑制,差异具有统计学意义。与对照组相比,ox-LDL处理组TLR4、NF-κB、RUNX2的表达明显升高,加入IL-37处理后,与ox-LDL处理组相比、IL-37(2h)+ox-LDL处理组相应因子的表达明显下降、NF-κB抑制剂PDTC(2h)+ox-LDL处理组与IL-37(2h)+ox-LDL处理组具有相同趋势,但IL-37的抑制效果优于PDTC。qpcr结果提示与对照组相比,ox-LDL处理组SMA、SM22α的表达明显下降,增加IL-37、PDTC处理后,与ox-LDL处理组相比,IL-37(2h)+ox-LDL处理组SMA、SM22α表达明显升高,而NF-κB抑制剂PDTC(2h)+ox-LDL处理组与ox-LDL处理组相比,SMA的表达上升而SM22α的表达是下降的。因此,我们认为IL-37抑制炎症通路,同时抑制成骨因子表达,影响细胞表型转化,发挥钙化保护作用。研究结论综上所述,我们认为IL-37可以通过抑制TLR表达,抑制NF-κB磷酸化、抑制下游成骨转录相关因子的表达,抑制HA-SMCs成骨转化,从而抑制HA-SMCs钙化,对于血管钙化保护作用,IL-37或可作为一个新型靶点,为血管钙化及AS治疗及预后提供新的理论基础。