目的:肠道纤维化是炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)的常见并发症,可发生在溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s disease,CD)中,但在CD中更为普遍。炎症性肠病中反复的肠道炎症促进间质细胞的激活并产生大量的细胞外基质(extracellular matrix,ECM),导致肠壁纤维化形成。近些年来生物制剂为炎症性肠病患者提供了高效的靶向治疗方案,但由于疾病早期症状隐匿、病程长,在反复的损伤愈合过程中患者仍不可避免出现肠道纤维化、肠腔狭窄的结局,严重降低了患者的生活质量。纤维化的机制是复杂和动态的,涉及多种细胞类型、相关的细胞事件和大量可溶性因子,由于炎症性肠病中上皮屏障的破坏,管腔细菌产物进入间质,通过激活免疫细胞和非免疫细胞诱导免疫反应,使肠道的细胞外基质组成发生了显著变化而形成纤维化。细胞外基质生成和降解的动态平衡在组织重塑中发挥着重要的作用,IBD患者的结肠组织中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)和金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs)表达水平是失衡的,这是IBD发生和发展的重要机制之一。目前用于IBD的抗炎疗法既不能预防也不能逆转纤维化,随着对其病理发生的细胞和分子机制的理解的提高,肠道纤维化不可逆性的观点正在逐渐改变,了解肠纤维化的机制可能为开发抗纤维化药物和新的IBD治疗方法铺平道路。白细胞介素-33(IL-33)与其受体ST2结合后通过下游信号传导可以促进2型细胞因子的分泌和ST2受体阳性的免疫细胞的存活和增殖。在组织损伤时,坏死细胞、受刺激的白细胞和上皮细胞可分泌大量的IL-33,这也是炎症性肠病时IL-33增加的原因,同时大量研究报道IL-33参与器官纤维化的过程,而IL-33/ST2轴在肠道纤维化中发挥的作用机制有待于深入研究。巨噬细胞的主要生理功能是吞噬作用和防御性分泌,研究报道CD患者存在巨噬细胞功能缺陷,表明其可能参与了IBD的发生和发展,此外巨噬细胞也是纤维化过程中的重要参与者,它具有高度可塑性,在不同环境中可以分化为M1型和M2型两种亚型,它们具有不同的生物功能和标记物表达,M1型巨噬细胞激活后高表达iNOS、TNFα等,M2型巨噬细胞激活可高表达Arg1、CD206等,研究中发现M2型巨噬细胞具有抗炎、修复、促纤维化倾向,且IL-33/ST2轴可增强M2型巨噬细胞表型,这些结果说明IL-33/ST2可能通过介导巨噬细胞极化调控肠道纤维化过程。TNFα是主要由单核巨噬细胞分泌的细胞因子,其在IBD的发生发展中起到重要作用,TNFα对肠道的损伤机制主要是破坏肠道上皮屏障、诱导细胞坏死或凋亡等,但是TNF-α并非只发挥单向的促炎作用,其作为复杂网络的参与者可进行有益的免疫调节,它在刺激下游促炎因子、趋化因子生成的同时也介导了抗炎因子的产生。TNFα靶向生物制剂是首个上市应用于IBD治疗的生物制剂,它与TNFα高亲和力结合,抑制TNFα与受体结合,从而使TNFα失去生物活性,其迅速改善肠道炎症、促进黏膜愈合的临床效果得到了专科医生的一致认可。NF-κB经典通路是TNFα发挥生物学功能、参与肠道炎症调控的主要途径之一,NF-κB激活后可以诱导下游基因进行转录,这些基因将免疫细胞的转录程序从静止状态转变为能够对抗病原体的增殖效应表型,从而在机体免疫中发挥关键作用。除了作为治疗靶点的作用外,TNF-α被发现有助于预测IBD患者对抗TNF-α治疗的反应,多项研究表明患者肠道中免疫细胞跨膜TNF-α(m TNF-α)表达的增加、外周血单核细胞TNF-α表达增高均预示对TNF-α单抗具有较好的应答,CD14~+单核巨噬细胞是产生上述的TNFα的主要来源,所以TNF-α在IBD中发挥的多向性功能还需进一步探讨。综上,鉴于IL-33/ST2轴对纤维化治疗的临床应用潜力,本研究将探讨IL-33/ST2轴对肠道纤维化的调控效果和机制。研究方法:1、肠道纤维化动物模型的建立和实验动物分组:应用梯度浓度的2,4,6-三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)建立小鼠肠道纤维化模型,动物模型建立的实验周期共8周,在适应性饲养1周后的第2周给予小鼠皮肤预敏,从第3周开始进行为期6周、每周一次的实验药物灌肠。动物实验设立对照组、实验组和治疗组三组:对照组使用生理盐水灌肠,实验组和治疗组使用梯度浓度的TNBS乙醇混合溶液灌肠;每组小鼠自第三次灌肠起,灌肠后6小时给予腹腔注射IL-33/ST2轴阻断剂ST2单抗(1.5μg/g)或者生理盐水100μl,共计4周;所有小鼠在最后一次药物灌肠后的第二天处死并取材。2、实验小鼠肠道标本纤维化程度、细胞因子表达及巨噬细胞表型评估:首先对小鼠一般情况、肠道形态外观进行比较;实验小鼠的肠道组织纤维化指标选取I型胶原蛋白(Type Ⅰ collagen,COL Ⅰ)、Ⅲ型胶原蛋白(Type Ⅲ collagen,COL Ⅲ)、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,αSMA)四种,应用RT-qPCR、Western Blot、Masson三色染色及免疫组织化学染色等方法评估纤维化指标的表达差异情况;同时对各组小鼠肠道组织中IL-33、TNFα、IL-1β和IL-6等细胞因子在mRNA和蛋白水平上的表达进行检测。F4/80+CD206双重标记是识别M2型巨噬细胞的经典方法,各组实验动物的肠道组织切片进行F4/80和CD206的双重免疫组化染色评估体内巨噬细胞极化情况,通过双重免疫组化染色计算肠道组织M2型巨噬细胞数量占巨噬细胞总数量的比例。Arg1主要由M2型巨噬细胞表达,应用RT-qPCR、免疫组织化学方法测定肠道组织Arg1表达水平以评估M2型巨噬细胞的极化程度。3、应用梯度浓度IL-33重组蛋白作用于人肠道成纤维细胞,通过RT-qPCR、Western Blot等方法评估COL Ⅰ、COL Ⅲ、FN和αSMA在人肠道成纤维细胞的表达情况以明确其对该细胞活化的作用,来评估IL-33对肠道ECM形成的直接作用。4、分别使用脂多糖和IL-4诱导小鼠巨噬细胞分化为M1型或M2型巨噬细胞,进行巨噬细胞极化造模。在分化后的小鼠巨噬细胞中加入IL-33重组蛋白,应用RT-qPCR及Western Blot评估IL-33对M1型及M2型巨噬细胞极化标志物iNOS、TNFα、IL-1β和IL-6及Arg1和TGFβ1表达的影响。5、将小鼠肠道组织TNFα与四种纤维化指标-COL Ⅰ、COL Ⅲ、FN和αSMA的mRNA表达相对量进行相关性分析;应用Western Blot评估各组小鼠肠道组织中NF-κB通路蛋白p65、磷酸化p65及IκBα的表达情况。6、应用TNFα重组蛋白刺激人肠道成纤维细胞,通过RT-qPCR、Western Blot等方法评估四种纤维化指标-COL Ⅰ、COL Ⅲ、FN和αSMA的表达;TNFα是NF-κB通路的激动剂,为研究TNFα对肠成纤维细胞的作用是否有该通路参与,加入NF-κB通路抑制剂对比通路激活前后纤维化指标、MMP9、TIMP1的表达在mRNA及蛋白层面的改变。结果:1、应用ST2单抗阻断IL-33/ST2轴后,实验组与治疗组的大肠组织形态评分均高于对照组(P<0.01或0.05),但前两组间无统计学差异;治疗组和实3-Methyladenine NMR验组小鼠的肠道重量显著高于对照组(P<0.01或<0.05)、体重显著低于对照组(P<0.05),治疗组和实验组在肠道重量和实验后小鼠体重上无统计学差异,三组小鼠在肠道长度上无统计学差异。2、通过RT-qPCR法分别对小鼠肠道组织进行COL Ⅰα1、COL Ⅲα1、FN和αSMA的mRNA表达进行检测。实验组和治疗组四种纤维化指标mRNA表达均高于对照组(P<0.01),且治疗组四种纤维化指标mRNA的表达显著低于实验组(P<0.01或<0.05)。应用Western Blot方法检测各组COL Ⅰ、COL Ⅲ、FN和α-SMA的蛋白表达情况,实验组四种纤维化指标均高于对照组(P<0.01或<0.05),治疗组中除α-SMA外其他三种纤维化指标的蛋白表达量均较实验组明显下降(P<0.05)。Masson三色染色是结缔组织染色中的经典方法,其中蓝色染色区域显示胶原纤维所在位置。对各组小鼠肠道切片进行HE染色和Masson染色,HE染色显示实验组和治疗组较对照组上皮层和黏膜下层炎性细胞浸润增多,黏膜肌层、黏膜下层增厚,腺体排列不规则。Masson染色结果显示蓝色区域所代表的胶原纤维在实验组中明显增多,且治疗组<实验组(P<0.05)。应用免疫组织化学方法对小鼠肠道组织COL Ⅰ、COL Ⅲ、FN和α-SMA进行染色,前三者主要分布在上皮固有层腺体间、黏膜下层;α-SMA主要在平滑肌细胞和肌成纤维细胞表达,这两种细胞主要分布在黏膜肌层和肌层,实验过程中发现纤维化加重时也可在上皮固有层腺体间显色。通过统计得出,实验组四种纤维化指标的范围、程度高于对照组,而且治疗组的纤维化程度低于实验组(P<0.01或0.05)。对各组小鼠肠道组织进行IL-33、TNFα、IL-1β和IL-6在mRNA和蛋白水平的检测,得出IL-33、TNF-α、IL-1β和IL-6在实验组明显升高(P<0.01)且IL-33、IL1β和IL6在治疗组降低(部分P<0.01或0.05),TNF-α的表达在治疗组中高于实验组(P<0.05)。3、小鼠肠道组织切片进行免疫组化F4/80、CD206双重染色,分别对F4/80(+)+CD206(+)双阳性细胞和F4/80(+)单阳性细胞进行计数,用两者比值评估M2型巨噬细胞占整体巨噬细胞比例,经过统计得出治疗组双阳性细胞与单阳性细胞的比值显著低于实验组(P<0.01)。通过RT-qPCR方法对实验小鼠肠道组织Arg1的表达进行检测,得出Arg1 mRNA在实验组表达升高,且在治疗组表达较实验组下降(P<0.01)。对各组小鼠肠道组织切片进行Arg1的免疫组化染色,提示Arg1在实验组肠道组织中表达增多,且治疗组染色阳性范围小于实验组。4、IL-33重组蛋白作用于人肠成纤维细胞,得出:部分浓度IL-33促进COL3α1的mRNA表达,最高上升至1.2倍(P<0.01或<0.05),同样的,100ng/ml的IL-33可显著升高COL Ⅲ的蛋白表达,较对照组升高0.6倍(P<0.05);而IL-33对其余三种纤维化指标mRNA和蛋白表达无明显改变。5、应用脂多糖以1μg/ml浓度和IL-4以10ng/ml浓度诱导未分化的小鼠巨噬细胞分别向M1、M2型巨噬细胞转化。将梯度浓度的小鼠重组IL-33蛋白和脂多糖或IL-4同时加入到巨噬细胞中,来评估IL-33对已分化的巨噬细胞表型的影响。M1型巨噬细胞经过梯度浓度重组IL-33刺激24小时后,经RT-qPCR检测得出其标志物iNOS和TNF-α的mRNA水平较LPS单药组降低(P<0.05),但IL-1β和IL-6的mRNA表达水平升高,其中IL-1β的升高具有统计学意义(P<0.05)。应用Western Blot进行上述四种M1型巨噬细胞标志物的蛋白表达水平检测,分别将不同浓度IL-33处理组和LPS单药组进行半定量分析比较,得出IL-1β和IL-6蛋白水平均不同程度增高(P<0.05),TNF-α的蛋白表达水平下降(P<0.05)。M2型巨噬细胞经过梯度浓度重组IL-33蛋白刺激24小时后,经RT-qPCR检测得出其标志物Arg-1和TGFβ1 mRNA相对表达量变化,结果显示Arg-1的mRNA表达呈现上升的趋势,部分浓度IL-33可显著增加Arg-1表达(P<0.05);TGFβ1 mRNA表达虽随药物浓度升高递增但没有统计学意义,应用Western Blot进行上述两种M2型巨噬细胞标志物的蛋白表达水平进行检测,得出在部分浓度IL-33促进两者的蛋白水PCB biodegradation平升高(P<0.05),其他药物浓度虽然表达同样升高但无统计学意义。6、对照组、实验组和治疗组实验动物肠道组织的TNFα和四种纤维化指标mRNA相对表达量进行相关性分析,其中TNFαmRNA相对表达量和α-SMA mRNA呈显著性负相关(P<0.05)。对三组实验小鼠的肠道组织进行NF-κB通路蛋白的Western blot检测,经过半定量分析得出阻断IL-33/ST2轴使IκBα蛋白表达减少及磷酸化NF-κB p65蛋白表达增多(P<0.05)。7、梯度浓度TNF-α重组蛋白加入人肠成纤维细胞后,经过RT-qPCR检测得出,TNF-α可显著降低COL3α1、α-SMA的mRNA表达(P<0.01或<0.05),对COL1α1和FN的mRNA表达无影响。Western blot结果得出,TNF-α可降低FN和α-SMA的蛋白表达,与对照组相比存在统计学差异(P<0.01或<0.05)。8、为明确TNF-α是否通过NF-κB通路调控肠成纤维细胞的纤维化指标表达,选用NF-κB通路抑制剂联合处理肠成纤维细胞。首先对NF-κB通路抑制剂的浓度进行筛选,通过显微镜下观察细胞生存率和Western blot测定通路蛋白及其磷酸化表达情况,最终选择浓度5μM、提前于TNF-α2小时加入细胞中的通路抑制剂给药方式进行后续实验。将人肠成纤维细胞分为三组:对照组、TNF-α(30ng/ml)组、TNF-α+NF-κB通路抑制剂组,Western确认细节 blot得出FN、α-SMA的蛋白表达在抑制NF-κB通路后升高(P<0.05)。通过RT-qPCR和Western blot检测得出,TNF-α可显著增加MMP9的mRNA和蛋白表达(P<0.05),并可以被NF-κB通路抑制剂降低(P<0.05);TIMP1在TNFα作用下蛋白表达较对照组有显著增高(P<0.05),加入通路抑制剂对TIMP1蛋白表达无影响,TIMP1的mRNA表达水平在三组间无差异。MMP9和TIMP1根据蛋白空间构型证实为1:1结合,对MMP9和TIMP1的mRNA和蛋白相对表达量进行计算比值,然后进行组间比较,得出在mRNA层面三组组间均存在差异,表现为TNF-α组>TNF-α+NF-κB通路抑制剂组>对照组(P<0.01或P<0.05),蛋白层面MMP9和TIMP1的比值在TNF-α组显著高于TNF-α+NF-κB通路抑制剂组(P<0.05),以上提示TNF-α可以通过激活NF-κB通路提高MMP9表达和MMP9/TIMP1比值。结论:1、在动物实验中,阻断IL-33/ST2轴可减轻肠道纤维化,减少肠道组织IL-1β和IL-6表达、增高TNFα表达,减少肠道组织中M2型巨噬细胞比例。2、IL-33促进肠道成纤维细胞表达Ⅲ型胶原,并对已分化的巨噬细胞极化状态具有调控作用:其可减少M1型巨噬细胞表达TNFα,可促进M2型巨噬细胞表达Arg1和TGFβ1。3、小鼠肠道组织中TNF-α和αSMA的表达量具有显著负相关,阻断IL-33/ST2轴可使NF-κB活化。4、TNF-α可抑制人肠成纤维细胞的纤维化指标表达;TNF-α通过NF-κB通路降低FN和αSMA表达,增加MMP9表达和MMP9/TIMP1比值。