背景神经母细胞瘤(Neuroblastoma,NB)是一种常见于婴幼儿的恶性肿瘤,发病率位于儿童常发肿瘤第四位,死亡人数占儿童肿瘤死亡病例15%。据统计,60%患儿为高危型神经母细胞瘤(HR-NB),其常规治疗包括:诱导化疗(IC)、局部手术、高剂量化疗(HDC)、自体干细胞移植、局部放疗以及13-顺式维甲酸诱导分化和免疫维持治疗。约有半数的HR-NB患者对常规治疗方案没有明显反应,或者治疗两年内复发;最新研究表明,HR-NB五年生存率为51.2%。因此,探寻HR-NB分子病理机制、了解疾病发展规律、开发新的治疗方法、提高高危组患者的生存率具有重要的科学意义和社会意义。有研究表明50%的HRNB患者具有MYCN扩增,MYCN扩增与肿瘤的恶性增殖、转移以及不良预后密切相关。鉴于癌基因MYCN扩增可作为HR-NB的分子生物学标志物以及其强大的促肿瘤发生发展的作用,N-Myc一直都是神经母细胞瘤研究领域的热门靶点。目的N-Myc由于其核定位、缺乏明确的分子结合口袋、没有酶活性等原因,被认为是“不可成药(undruggable)”靶点。研究报道糖原合酶激酶GSK-3www.selleck.cn/products/lgx818β介导NMyc磷酸化/泛素化降解,我们的前期研究则发现GSK-3β促进MYCN表达在神经母细胞瘤中占主导地位。拟深入探究GSK-3β在神经母细胞瘤中对MYCN调节作用的分子机制及其生物学功能,并探讨干预GSK-3β进而间接靶向N-Myc治疗HR-NB的策略。方法首先利用NB患者的组织芯片(Tissue Array)进行免疫组化实验分析GSK-3β的表达水平。随后利用RNAi或抑制剂处理NB细胞,MTT检测GSK-3β激酶活性或表达缺失后NB细胞增殖能力的变化。进一步通过免疫印迹、荧光定量PCR、蛋白半衰期实验等分子生物学手段研究GSK-3β对N-Myc的调控方式。接着运用生物信息学方法、免疫印迹、蛋白质半衰期等实验明确GSK-3β通过磷酸化E2F1增强其稳定性从而促进MYCN转录。同时开展过表达E2F1的实microbiome composition验考察E2F1回补能否挽救GSK-3β缺失引起的细胞活力减弱。由于抑制GSK-3β后,抗凋亡蛋白MCL1表达显著上调,因此在体外细胞模型和体内裸鼠移植瘤实验中评价GSK-3β抑制剂协同MCL1抑制剂的抗肿瘤作用。结果组织芯片免疫组化染色分析结果显示GSK-3β在NB患者中高表达。抑制GSK-3β的活性或表达后,NB细胞增殖减慢,MCL1蛋白增加,MYCN、CCNE1蛋白和m RNA水平降低。相关分子机制实验表明GSK-3β可能通过磷酸化E2F1MK-1775说明书从而增强其蛋白稳定性促进MYCN、CCNE1转录。过表达E2F1可以挽救GSK-3β缺失引起的细胞增殖减缓以及N-Myc和Cyclin E1表达。GSK-3β抑制剂CHIR99021与MCL1抑制剂S63845可以协同诱导NB细胞凋亡,抑制裸鼠移植瘤生长,联用时N-Myc表达明显更低,凋亡相关蛋白cleaved caspase-3表达量更高。结论GSK-3β在神经母细胞瘤中发挥促癌作用。GSK-3β可能通过磷酸化E2F1增强其蛋白稳定性,进而间接促进MYCN、CCNE1转录。GSK-3β抑制剂与MCL1抑制剂协同致死神经母细胞瘤细胞。本课题阐明了GSK-3β在神经母细胞瘤中的重要生物学功能,揭示了GSK-3β促进MYCN表达的分子新机制,提出了靶向GSK-3β/E2F1/N-Myc治疗神经母细胞瘤的新策略。