研究背景与目的:目前,结直肠癌是世界第四大癌症,占全世界所有年确诊和癌症相关死亡的10%,每年约90万人死亡。肝脏和肺是CRC患者最常见的转移部位,骨是晚期结直肠癌第三位转移部位,发生率约为10%-15%。尽管骨转移较其他部位转移发生率更低,但肿瘤骨转移所致病理性骨折、疼痛、高钙血症等骨相关事件(Skeletal-Related Events,SREs)成为癌症相关死亡的主要原因,骨转移影响生活质量,降低总生存期。随着中国老年化社会的到来,结直肠癌的发病率逐渐上升,面临的医疗负担随之增加。新型抗肿瘤药物的不断涌现,以及高精度放射治疗的普及应用,结直肠癌患者生存期逐渐提高。但肿瘤晚期合并骨转移的患者,5年生存率仍较低。如何提高CRC骨转移的治疗效果,还需更多的研究。与其他大多数原发及转移性恶性肿瘤一样,骨破坏与破骨细胞激活、成骨细胞及破骨细胞平衡失调密切相关。破骨细胞来源于骨髓单核巨噬细胞,在肿瘤微环境中异常激活,使成骨细胞-破骨细胞失调,最终介导骨破坏。乳腺癌、肺癌和前列腺癌是骨转移最常见的三大恶性肿瘤,破骨细胞如何参与骨破坏的机制已有非常多的研究。不同的恶性肿瘤,其发生、发展、转移过程存在差异,肿瘤微环境中的细胞成分、细胞因子种类及含量也可能存在差异。破骨细胞如何参与结直肠癌骨转移,目前的研究较少。G蛋白偶联受体(GPRs)是一大类更多膜蛋白,在介导细胞对外界刺激的反应中起着重要作用,参与众多的生理及病理活动,包括发育、激素稳态、调节代谢、摄食行为、介导炎症反应。GPRs在癌细胞与其他细胞的相互作用中发挥作用,一些GPRs家族成员已被报道参与肿瘤转移。在骨转移中,卵巢癌GPR1介导癌细胞和成骨样细胞之间的通讯。GPR65/ADGRG1在乳腺癌细胞系4T1细胞和骨转移灶中表达上调。Mi R-7062-5p下调OCPs中GPR65的表达。GPR120增加胰腺癌细胞的运动和侵MRTX1133浓度袭活性,而GPR40的作用刚好相反。GPR84是一种促炎受体,主要表达于骨髓单核/巨噬细胞、外周白细胞及肺,参与介导炎症及免疫反应。单核/巨噬细胞是破骨细胞的来源,有研究显示,GPR84过表达通过NF-κB和MAPK信号通路负性调节RANKL诱导的破骨细胞分化。但是GPR84在结直肠癌骨转移灶中的表达情况,是否参与肿瘤的进展,以及对破骨细胞的作用及机制尚不清楚。在此,我们探讨了GPR84在结直肠癌骨转移中的作用,为寻找潜在治疗靶点提供思路。材料和方法:1.利用MC-38细胞,构建小鼠结肠癌胫骨转移模型。在第0/3/7/14天处死小鼠,获取胫骨BMMs。q RT-PCR检测不同时间点骨转移部位GPR84 m RNA相对表达量。免疫荧光染色分析不同时间点BMMs中GPR84的表达情况。Western-Blot检测各时间点GPR84蛋白表达情况。2.获取正常小鼠骨髓细胞,在含有M-CSF的培养基中培养,获取BMMs。试验组培养基内加入GPR84激动剂6-OAU,对照组加入PBS,抗原抗体孵育后,Brdu标记并进行流式细胞分析。q RT?PCR检测细胞周期生物标志物Cenpa,Cdc20,Cdk1,Ccnd1 m RNA表达量。3.提取正常小鼠骨髓BMMs,将其置于MC-38细胞来源CM(condition medium),加入RANKL、M-CSF进行破骨细胞诱导。用6-OAU和过表达GPR84的质粒处理BMMs,TRAP染色检测破骨细胞数量。q RT-PCR检测两种经典破骨细胞生物标志物OCSTAMP、CTSK m RNA表达量。4.获取正常小鼠BMMs,并在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的α-MEM、M-CSF(50 ng/m L)、RANKL(100 ng/m L)培养基中培养,用过表达GPR84的质粒转染BMMs。Western-Blot检测p38MAPK/JNK/ERK磷酸化水平。使用anisomycin、t BHQ激活JNK、ERK通路,TRAP染色检测破骨细胞数量。5.小鼠来源BMMs于CM培养基中培养4Polymer bioregeneration8小时,q RT-PCR测定GPR84 m RNA的表达量。BMMs培养基内分别加入EGF,IL-11,CTGF,PTHr P,q RT-PCR测定GPR84m RNA表达量。CM中培养BMMs,使用IL-11及IL-11Nab处理,测定GPR84 m RNA表达量。结肠癌骨转移动物模型小鼠胫骨髓腔分别注射IL-11及IL-11Nab,造模第7天处死小鼠,获取BMMs。q RT-PCR测定GPR84 m RNA表达量。在IL-11和IL-11+6OAU处理组,TRAP染色检测破骨细胞数量。6.小鼠BMMs在CM培养基中培养,分别用IL-11、IL-11Nab处理,Western-Blot检测STAT1磷酸化水平及GPR84蛋白表达水平。使用STAT1过表达的质粒转染BMMs,并用IL-11处理,q RT-PCR检测GPR84 m RNA的表达。7.在结肠癌小鼠模型中,使用GPR84激动剂处理,3周后获取小鼠胫骨组织行TRAP染色。利用μ-CT对小鼠胫骨进行相关参数测定,包括:BMD,BV/TV,TB.Th,Tb.N,Tb,Sp。结果:1.GPR84表达于正常小鼠BMMs,随着CRC骨转移的进展,GPR84 m RNA、蛋白表达水平均下调。2.GPR84不影响BMMs的增殖,激活或过表达GPR84,破骨细胞数量及破骨细胞生物标志物m RNA表达量均明显下降。3.GPR84过表达使JNK、ERK、p38 MAPK通路磷酸化水平下降,激活JNK、ERK通路,破骨细胞数量增加。4.四种常见的肿瘤细胞分泌的细胞因子中,只有IL-11抑制GPR84 m RNA的表达,IL-Nab可逆转这种作用。动物实验显示,肿瘤细胞来源IL-11部分抑制早期OCPS中GPR84的表达,破骨细胞数量增加,激活GPR84可逆转这种作用。5.肿瘤细胞来源IL-11抑制STAT1磷酸化水平,抑制GPR84的表达。6.动物模型实验表明,激活GPR84抑制破骨细胞生成,减轻肿瘤骨转移所致骨破坏。结论:本研究结果显示,GPR84通过MAPK通路负向调控破骨细胞生成,肿瘤细胞来源的IL-11通过抑制STAT1的激活部分抑制GPR84的表达。激活GPR84抑制肿瘤微环境中破骨细胞的生成,减轻CRC骨转移所致骨破坏。