研究背景与目的脓毒症是一种由感染引起的潜在致命的器官功能障碍性疾病。作为一种高致死率的疾病,脓毒症可导致细胞功能障碍,最终引起器官衰竭。肝脏是人体重要的免疫监视器官,由于常暴露于各种有害因素下,还容易成为脓毒症相关损伤的靶点。肝功能障碍是脓毒症的早期表现,也是脓毒症死亡率的独立预测指标。铁死亡是最常见和最古老的细胞死亡形式之一,其特征是不受控制的脂质过氧化。目前研究表明,铁死亡可以出现在各种肝脏疾病中,抑制铁死亡Telaglenastat使用方法可以减轻肝脏的损伤。大多数细胞表面受体属于G蛋白偶联受体(GPCR)家族,由于可以识别广泛的细胞外分子,参与许多生理和病理过程,GPCRs成为极具潜力的药物研究靶点。G蛋白偶联受体116(GPR116/ADGRF5)是黏附G蛋白偶联受体家族的成员,具有调节肺泡表面活性物质含量、参与肾脏酸分泌、增加胰岛素对白色脂肪组织的敏感性等功能。但其在脓毒症相关肝损伤中的作用尚未被报道。本研究旨在阐明GPR116在脓毒症相关肝损伤Baf-A1发生发展中的作用和机制,以及与铁死亡的关联,为脓毒症相关肝损伤的防治提供潜在的生物标志物和治疗靶点。研究方法1.体内实验(1)GPR116在脓毒症肝损伤中表达变化的研究选择雄性C57BL/6小鼠(8～12周,20～25 g,无特殊病原)随机分成2组:对照组和实验组,所有小鼠均喂食标准的食物和水,并在使用前使其适应环境。使用七氟醚麻醉小鼠,实验组小鼠用23号针建立盲肠结扎和穿刺(CLP)引起的脓毒症模型,对照组小鼠单纯开腹而不做盲肠结扎手术。在不同的时间点(0h、24h、48h)麻醉小鼠,心脏取血后处死小鼠,同时收集肝脏组织。利用全自动生化分析仪检测血清中的谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)、谷草转氨酶(aspertate aminotransferase,AST)的水平,同时利用不同的生化试剂盒检测肝脏组织中的丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)、水平。H&E染色观察肝脏损伤情况,透射电镜观察肝脏线粒体损伤情况。Western Blot法检测肝脏组织中GPR116和GPX4等蛋白的表达情况。(2)GPR116在脓毒症小鼠肝损伤中作用及机制的研究构建GPR116肝细胞特异性敲除小鼠(GPR116~(fl/fl)Alb~(cre-/-)小鼠)。8～12周雄性GPR116~(fl/fl)Alb~(cre+/+)和GPR116~(fl/fl)Alb~(cre-/-)小鼠(20～25 g)随机分为:GPR116~(fl/fl)Alb~(cre+/+)+SHAM组、GPR116~(fl/fl)Alb~(cre+/+)+CLP组、GPR116~(fl/fl)Alb~(cre-/-)+SHAM组、GPR116~(fl/fl)Alb~(cre-/-)+CLP组,模型建立方法如前所述,所有小鼠均喂食标准的食物和水,并在使用前使其适应环境。48h后,麻醉小鼠,心脏取血后处死小鼠,同时收集肝脏组织,在此期间记录48h生存率。利用全自动生化分析仪检测血清中的谷丙转氨酶、谷草转氨酶的水平,利用不同的生化试剂盒检测肝脏组织中的丙二醛、谷胱甘肽(glutathione,GSH)的水平。H&E染色观察肝脏损伤情况,透射电镜观察肝脏线粒体损伤情况。Western Blot法检测肝脏组织中GPR116、GPX4、SLC7A11、SLC3A2的表达情况。免疫组化染色法检测4-羟基壬烯醛(4-Hydro-xynonenal,4-HNE)的表达情况。使用铁死亡抑制剂Liproxstatin-1处理小鼠,检测4-HNE、ALT、AST和肝组织H&E染色,验证铁死亡在脓毒症肝损伤中的重要作用。2.体外实验:验证GPR116在脓毒症小鼠肝损伤中的作用机制体外培养小鼠肝细胞(AML12 cells),消化细胞,并按50～70%的密度接种到6孔板,37℃、5%CO_2、95%空气的恒温培养箱孵育过夜,第二天换液之后将GPR116进行高表达或干扰处理。当细胞密度达到70%～80%时加入Erastin 10μmol刺激24h后收集细胞。结果1.GPR116在脓毒症小鼠的肝组织中表达上调CLP后,与SHAM组相比,CLP组的小鼠肝脏中GPR116的表达显著上调,峰值出现在48 h。CLP造模后也可观察到肝组织出现铁死亡。提示GPR116有可能参与脓毒症肝损伤的发生发展过程。2.肝细胞特异性缺失GPR116的脓毒症小鼠肝损伤减轻CLP后,与GPR116~(fl/fl)Alb~(cre+/+)小鼠相比,肝细胞特异性缺失GPR116(GPR116~(fl/fl)Alb~(cre-/-))的小鼠肝损伤减轻,死亡率也显著下降。说明肝细胞特异性缺失GPR116的脓毒症小鼠肝损伤减轻,肝细胞GPR116可能促进了脓毒症肝损伤进展。3.GPR116通过抑制System Xc~-/GSH/GPX4通路,促进肝脏铁死亡,加重肝损伤CLP后,GPR116~(fl/fl)Alb~(cre-/-)小鼠肝脏组织中铁死亡相关蛋白(GPX4、SLC7A11、SLC3A2)的表达增加;而GPR116~(fl/fl)Alb~(cre+/+)则出现了相反的结果。说明GPR116通过抑制System Xc~-/GSH/GPX4通路,促进肝脏铁死亡,从而加重了肝损伤。4.GPR116加重Erastin刺激的AML12细胞的损伤GPR116 si-RNA干扰,Erastin(一种铁死亡激动剂)处理AML12细胞后,与对照组相比,GPR116干扰组细胞死亡率更低;而GPR116高表达处理,Erastin刺激细胞后,与对照组相比,GPR116高表达组细胞死亡率更高。说明GPR116加重了Erastin刺激的AML12细胞的损伤。5.GPR116通过抑制system Xc~-/GSH/GPX4通路,促进AML12细胞的铁死亡GPR116干扰,Erastin处理AML12细胞后,与对照组相比,GPR116干扰组铁死亡相关蛋白(GPX4、SLC7A11、SLC3A2)的表达增加;而GPR116高表达处理,Erastin刺激细胞后,与对照组相比,GPR116高表达组铁死亡相关蛋白表达降低。说明GPR116通过抑制System Xc~-/GSH/GPX4通foetal immune response路,促进AML12细胞铁死亡。结论在脓毒症肝损伤中,GPR116在肝组织的表达增加,并通过抑制System Xc~-/GSH/GPX4通路,促进铁死亡的发生,加重肝组织损伤。