第一部分2型糖尿病患者肌肉含量与体内GLP-1水平的关系目的:肌肉减少加重2型糖尿病患者的糖代谢紊乱,GLP-1类似物是目前应用的新型降糖药物,它除降糖作用外具有多器官多靶点保护效应,那么是否对于肌肉减少有影响,本实验探讨了2型糖尿病患者GLP-1水平与骨骼肌含量的关系。方法:回顾选取2020年3月至2021年2月我院住院的非肥胖男性2型糖Paramedian approach尿病患者51例,年龄(59.86±8.41),收集受试者糖尿病病史,测量所有受试者血压、身高、体重并计算体重指数(BMI),空腹8 h后于次日晨起抽取静脉血用于检测空腹血糖(FBG)、血脂水平(TC、TG、HDL-c、LDL-c)及糖化血红蛋白(Hb A1c),应用ELISA法测定GLP-1和DPP-4水平。采用双能X线骨密度仪(DXA)测量所有受试者的骨骼肌含量从而计算骨骼肌指数(SMI),以SMI做分组,A组(n=25,SMI<7 kg/m2)、B组(n=26,SMI≥7 kg/m2)。结果:1.A组和B组两组之间在病程、年龄、空腹血糖、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和DPP4的水平,差异没有统计学意义(P>0.05),A组GLP-1水平显著低于B组[(0.3(0.22)vs(0.5(0.20)ng/ml,P<0.01]。2.单因素分析显示SMI与GLP-1呈正相关(r=0.526,P<0.05)。3.多元线性回归分析显示年龄(β=-0.299,95%CI:-0.054～-0.009,P=0.015)与SMI负相关,而GLP-1(β=0.435,95%CI:0.18～1.612,P=0.001)与SMI正相关。4.二元Logistic回归分析显示以SMI为自变量,以年龄、病程、空腹血糖、糖化血红蛋白、GLP-1水平为因变量,GLP-1水平在P_(50th)以下发生低SMI的风险是P_(50th)以上的10.55倍(95%CI:2.894-38.504,P=0.001)。结论:GLP-1水平在2型糖尿病合并低SMI患者体内是下降的。2型糖尿病中SMI与GLP-1水平独立正相关,随GLP-1水平下降,低SMI的风险明显增加。第二部分GLP-1受体激动剂缓解2型糖尿病小鼠肌肉减少的机制研究目的:探讨GLP-1受体激动剂利拉鲁肽通过直接抑制MAFbx和Mu RF1的表达缓解糖尿病小鼠肌肉减少。方法:1.细胞部分1)以不同浓度利拉鲁肽(100n M,200n M,500n M)对体外培养的C2C12细胞进行刺激,48小时后应用MTT法进行细胞活性检测。2)按照分组将细胞加入药物:对照组(未处理组)、阴性对照组(甘露醇25mmol/L)、高糖组(葡萄糖25mmol/L)、高糖+利拉鲁肽组(葡萄糖25mmol/L+利拉鲁肽200nmol/L),应用Western blot对骨骼肌特异性泛素蛋白酶E3(MMC3供应商AFbx和Mu RF1)和AMPKα蛋白表达水平进行测定。采用ELISA法对3-MH进行检测。2.动物部分将KK-Ay小鼠分为两组,利拉鲁肽治疗组(250ug/kg/d)和等量生理盐水治疗组,每3天记录进食量情况,干预8周。应用骨密度仪测量其脂肪(Fat)和骨骼肌含量(SMM)。在处死小鼠前对小鼠进行眼球取血,应用葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖浓度,断颈处死后快速解剖留取四肢的骨骼肌组织,PBS缓冲液冲洗,吸干表面残留液体,电子天平称重,得到湿重。提取骨骼肌RNA及蛋白质,应用Real-time RT-PCR和Western blot对小鼠骨骼肌MAFbx和Mu RF1的m RNA和蛋白水平进行检测。结果:1.高糖组较甘露醇组和对照组的AMPKα水平明显下降(P<0.01),利拉鲁肽-200干预后AMPKα水平明显升高(P<0.05)。2.高糖组MAFbx和Mu RF1水平明显高于空白对照组和甘露醇组(P<0.01),利拉鲁肽-200干预后MAFbx和Mu RF1水平明显较高糖组降低(P<0.01)。3.甘露醇组和空白对照组3-MH水平无差别,高糖组3-MH水平明显高于空白对照组和甘露醇组(P<0.01),利拉鲁肽-200干预后3-MH水平较高糖组明显降低(P<0.05)。4.KK-Ay小鼠应用利拉鲁肽组较盐水治疗组进食量减少、体重减轻(P<0.01)、血糖下降(P<0.05)。利拉鲁肽治疗组小鼠四肢骨骼肌湿重较生理盐水组有明显升高(P<0.01)。5.利拉鲁肽治疗组的KK-Ay小鼠骨骼肌Mu RF1和MAFbx的m RNA和蛋白表达水平较盐水组明显下降(P<0.05)。结论:高糖环境下AMPKα的表达受抑制,而MAFbx和Mu RF1的m RNA和蛋白水平表达增加,3-MH表达增加即骨骼肌蛋白质分解增加,而利拉鲁肽干预后可缓解这一病理过程。利拉鲁肽能降低糖尿病小鼠的血糖、减轻体重,骨骼肌含量增加,在糖尿病小鼠骨骼肌组织同样可观察到利拉鲁肽对Mu RF1和MAFbx的m RNA和蛋白表达水平有抑制作用。第三部分GLP-1受体激动剂缓解肌肉减少的机制探讨目的:通过地塞米松制造肌肉减少模型,应用GLP-1受体激动剂(利拉鲁肽)干预,观察其缓解肌肉减少的机制。方法:1.将体外培养的C2C12肌细胞用不同浓度利拉鲁肽(10n M,100n M,1000n M)进行刺激,分为空白对照组、利拉鲁肽10 n M组、利拉鲁肽100n M组、利拉鲁肽1000 n M组,对C2C12细胞进行荧光染色,DAPI染色细胞核,以MHC染色评估肌管分化效率。2.将体外培养的C2C12细胞用10u M地塞米松处理制造肌肉减少模型,以不同浓度利拉鲁肽(10n M,1000n M)进行干预,分为空白对照组、地塞米松组、地塞米松+利拉鲁肽10 n M组、地塞米松+利拉鲁肽1000 n M组,仍然进行荧光染色以MHC染色评估肌管分化效率。同时应用Real-time RT-PCR检测MAFbx和Mu RF1 m RNA的表达水平。3.将带有GFP荧光的MAFbx和Mu RF1过表达重组腺病毒进行转染,只表达GFP荧光的腺病毒作为阴性对照,并在MOI为100的条件下转染48 h,MHC染色评价肌管萎缩程度,应用Real-time RT-PCR检测MAFbx和Mu RF1 m RNA的表达水平。结果:1.MHC荧光强度随着利拉鲁肽浓度的增加而增强,利拉鲁肽-1000n M干预组MHC荧光强度最大;Real-time RT-PCR结果显示MAFbx和Mu RF1的m RNA表达水平随利拉鲁肽浓度的增加表达逐渐降低,利拉鲁肽-1000n M干预组下降最显著,差异有统计学意义(P<0.05)。2.地塞米松处理后MHC荧光强度明显下降,应用利拉鲁肽10n M、100n M和1000n M处理后荧光强度逐渐增加,利拉鲁肽-1000n M干预组增加最明显,差异有统计学意义(P<0.05)。3.Ad-GFP组地塞米松处理后MHC荧光强度明显减弱,应用利拉鲁肽1000n M后MHC荧光强度较前增加,差异有统计学意义。Ad-MAFbx和Ad-Mu RF1显著拮抗利拉鲁肽增加MHC荧光强度的作用,差异有统计学意义,(P<0.05)。结论:GLP-1受体激动剂利拉鲁肽以剂量依赖的方式促进成肌细胞分化,并以剂量依赖的selleck HPLC方式抑制MAFbx和Mu RF1 m RNA的转录表达。地塞米松处理组肌管形成显著减少,增加了细胞内MAFbx和Mu RF1的表达水平,利拉鲁肽以剂量依赖的方式降低其诱导的MAFbx和Mu RF1高表达进而改善肌管减少。利拉鲁肽在促进肌肉分化的同时也通过抑制MAFbx和Mu RF1的表达而缓解地塞米松诱导的肌肉减少。