第一部分GJ-4治疗大鼠血管性痴呆的作用及机制研究血管性痴呆(Vasculardementia,VD)是一种由脑血管病变致脑损伤而引起的以认知功能障碍为特征的综合征。除认知功能受损外,不同脑区损伤导致的伴随性症状各异,如性情改变、语言功能障碍等,除严重威胁患者身体健康外还会加重其心理压力,并给患者家属以及社会带来沉重的经济负担。栀子是传统中药,具有抗氧化、抗炎及抗感染的作用,也可减轻缺血导致的脑组织损伤。GJ-4是栀子果实的提取物,本实验室前期研究发现GJ-4可改善多种阿尔茨海默病selleck Bemcentinib(Alzheimer’s disease,AD)模型动物的学习记忆功能,但GJ-4对VD模型动物的作用以及作用机制仍未阐明,因此本实验主要探究GJ-4对永久性双侧颈总动脉结扎(Bilateral common carotid arteries occlusion,2-VO)诱导的VD大鼠的治疗作用,并以体内实验和体外实验相结合的方法来探讨GJ-4治疗VD的作用机制。在本实验中,我们首先采用2-VO建立了 VD大鼠模型,通过灌胃给予不同剂量GJ-4(10、25和50mg/kg)及阳性药多奈哌齐(5 mg/kg)、尼莫地平(10 mg/kg)和银杏叶提取物(50 mg/kg),持续30天。Morris水迷宫结果显示,GJ-4 50 mg/kg可明显缩短VD大鼠找到平台的潜伏期,增加大鼠穿越平台的次数,并延长大鼠在目标象限的停留时间。进一步的跳台实验发现GJ-4 50 mg/kg可显著延长大鼠在跳台上的停留时间,表明GJ-4具有改善VD大鼠学习记忆功能障碍的作用。多普勒脑血流量检测结果表明GJ-4 50 mg/kg可明显增加VD大鼠的脑血流量。尼氏染色结果表明GJ-450mg/kg可改善2-VO导致的大鼠海马CA1区尼氏小体排列扭曲,减轻脑血流量低灌注导致的神经元损伤。细胞凋亡在VD发病中起着重要的作用,Cleaved caspase-3是反映细胞凋亡的重要蛋白,免疫组化以及Western blot结果显示GJ-4可明显抑制Cleaved caspase-3的表达,表明GJ-4具有抑制神经元凋亡的作用。Iba-1免疫组化结果表明GJ-4可能具有抑制小胶质细胞激活的作用。内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)是由内质网腔内错误折叠/未折叠蛋白累积影响内质网正常功能而发生的应激状态,参与VD发病过程。错误折叠/未折叠蛋白会引发未折叠蛋白反应(Unfoldedprotein response,UPR)以恢复内质网中的蛋白质稳态以及内质网的功能。机制研究表明GJ-4可以显著降低VD大鼠脑中ERS相关蛋白质葡萄糖调节性蛋白质78(Glucose-regulated protein 78,GRP78)的表达水平,并通过抑 制调节 UPR 的PERKTravel medicine/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路的激活从而抑制细胞凋亡。进一步在SH-SY5Y细胞中采用糖氧剥夺(Oxygen glucose deprivation,OGD)模型模拟神经元在缺氧条件下的病变,结果与动物体内实验一致,发现ERS相关蛋白质GRP78的表达明显升高,同时PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路激活,而GJ-4主要代谢产物藏红花酸可以显著降低GRP78的表达水平,并抑制PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路的激活。上述结果表明GJ-4对2-VO所致VD大鼠模型具有较强的神经保护作用,可通过抑制PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路的激活缓解大鼠脑内ERS,减少神经元凋亡,改善大鼠的学习记忆障碍。血管新生是指新的血管从已有血管生成的过程,在缺血诱发的VD中促进血管新生是缓解VD症状的治疗方式之一。本研究进一步在人脐静脉血管内皮细胞(Human umbilic vein endothelial cells,HUVEC)中采用划痕实验、成管实验等方法研究藏红花酸对血管新生的影响,结果表明藏红花酸可显著增强HUVEC的迁移能力以及管腔形成能力。机制研究发现藏红花酸可能通过激动Sonic Hedgehog信号通路提高 HUVEC 中血管内皮生成因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)以及血管标记物血小板-内皮细胞黏附分子(Platelet endothelial adhesion molecule 1,CD31)的表达水平,从而起到促进血管新生的作用。综上所述,GJ-4可改善2-VO诱发的VD大鼠脑血流量降低,保护神经元,进而改善VD大鼠学习记忆障碍。机制研究表明GJ-4及其主要代谢产物藏红花酸的神经元保护作用可能与其抑制调控UPR的PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路的激活有密切关系。除了对ERS的抑制作用,藏红花酸还可通过激活Sonic Hedgehog信号通路来促进HUVEC的迁移及管腔形成,提高新血管生成的能力。本实验进一步证明GJ-4具有开发成为治疗VD新药的良好前景。第二部分TREM2通过调控小胶质细胞内吞功能参与神经炎症的作用及机制研究在中枢神经系统(Central nervous system,CNS)中,髓系细胞触发受体2(Triggering receptor expressed on myeloid cells 2,TREM2)主要表达在小胶质细胞膜上,具有影响小胶质细胞存活、增殖、迁移以及吞噬的功能,还可调控小胶质细胞的神经炎症反应。研究表明神经炎症在阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森氏病(Parkinson’s disease,PD)等神经退行性疾病以及血管性痴呆(Vascular dementia,VD)、脑卒中、创伤性脑病等疾病的发病和病理进程中具有关键作用。在病理过程中,小胶质细胞会迁移至病灶处,吞噬β-淀粉样蛋白(β-Amyloid,Aβ)、α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)等致病物质,以减轻其诱发的神经炎症。然而TREM2调控神经炎症的作用和机制尚未完全阐明,因此本研究主要在脂多糖(Lipopolysaccharides.LPS)侧脑室注射致神经炎症模型小鼠、OGD刺激的BV2小胶质细胞,以及不同VD模型大鼠中探究TREM2通过调控小胶质细胞内吞功能介导神经炎症的作用及可能的机制。本研究发现LPS刺激导致小胶质细胞中TREM2表达下降。为进一步探究其作用机制,本研究采用蛋白质组学寻找使用小干扰RNA(Small interference RNA,siRNA)敲低BV2中TREM2后的差异性表达蛋白。结果表明TREM2表达水平降低时网格蛋白介导的内吞(Clathrin-mediated endocytosis,CME)相关蛋白适配体蛋白复合体 2 亚基 α2(Adaptor related protein complex 2 subunit Alpha 2,AP2A2)、适配体蛋白复合体 2 亚基μl(Adaptor Related Protein Complex 2 Subunit Mu 1,AP2M1)以及动力蛋白2(Dynamin 2.Dnm2)的表达也明显降低,Western blot实验进一步验证发现TREM2低表达可降低内吞相关蛋白AP2A2、Dnm2和 AP2M1 的表达。采用免疫共沉淀(Co-immunopreciselleck BIBW2992pitation,Co-IP)检测 TREM2及上述蛋白之间的相互作用,结果表明TREM2可与AP2A2和Dnm2结合并存在蛋白质相互作用,进一步表明TREM2可直接调控小胶质细胞的内吞功能。内吞实验发现敲低BV2细胞中的TREM2可抑制小胶质细胞的内吞功能,验证了 TREM2与小胶质细胞内吞功能的密切相关。小胶质细胞介导的神经炎症与内吞功能有密切的关系,为探究TREM2通过调控内吞功能影响神经炎症的作用及机制,本研究建立了 LPS侧脑室注射致神经炎症小鼠模型。结果显示LPS侧脑室注射小鼠皮层和中脑中TREM2的表达明显降低,且内吞相关蛋白AP2A2、AP2M1和Dnm2的表达也随之显著降低,而炎症因子的表达升高,表明LPS刺激后小胶质细胞内吞功能损伤,引发了神经炎症。神经炎症可损伤血脑屏障(Blood brain barrier,BBB)从而提高BBB通透性,因此本研究采用Western blot检测了脑屏障相关蛋白Claudin-1和Occludin的表达,结果发现LPS刺激后屏障相关蛋白表达水平显著降低。而当用TREM2激动剂COG 1410提高TREM2活性时,内吞相关蛋白AP2A2、AP2M1和Dnm2的表达明显升高,炎症因子表达下降,屏障相关蛋白表达升高,表明激动TREM2改善了 LPS刺激对小胶质细胞内吞功能的损伤,炎症反应明显减弱,脑屏障功能改善。神经炎症在VD的病理变化中具有关键作用,因此本研究在BV2细胞中建立了糖氧剥夺(Oxygen glucose deprivation,OGD)模型观察TREM2调控内吞功能影响神经炎症的作用和机制。结果表明OGD明显降低了 TREM2及内吞相关蛋白表达水平,提高了炎症蛋白iNOS、COX-2的表达,表明OGD抑制了小胶质细胞的内吞功能并诱发了神经炎症。给予COG 1410提高TREM2的表达水平后,内吞相关蛋白的表达明显提高,OGD诱发的神经炎症明显减轻。然后本研究在双侧颈总动脉结扎(Bilateral carotid artery occlusion,2-VO)、急性局灶性脑缺血再灌注(Middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R)以及高脂饮食合并 2-VO(High fat diet+2-VO,HFD+2-VO)三种VD模型大鼠中进一步探索TREM2调控内吞功能对神经炎症的作用和机制。Western blot结果显示三种VD大鼠皮层中TREM2表达均显著降低,内吞相关蛋白的表达受到抑制,神经炎症反应加剧,脑屏障受损,表明TREM2通过调控内吞参与VD发病。综上所述,在小胶质细胞中TREM2可与内吞相关蛋白AP2A2和Dnm2相互作用,介导小胶质细胞内吞作用,参与神经炎症相关疾病的病理过程。在VD等存在神经炎症的疾病模型中,TREM2和内吞相关蛋白表达均降低,而激活TREM2可提高小胶质细胞的内吞功能,减轻炎症反应,改善脑屏障功能。以上结果进一步表明TREM2是调控神经炎症的重要分子靶点,可能具有开发为治疗VD等疾病靶点的潜力。