目的:甲状腺乳头状癌是甲状腺癌中最常见的病理亚型,占总发病率的85%～90%。普遍认为甲状腺乳头状癌具有良好的预后效果,但是部分甲状腺乳头状癌可转变为更具侵袭性的表型,转移到淋巴结或远处组织,并去分化为致命的甲状腺癌。随着甲状腺癌发病率和复发率的快速增长,寻找新的治疗靶点和探索甲状腺癌发生发展的新机制迫在眉睫。γ-谷氨酰胺环化转移酶(GGCT)是一种参与谷胱甘肽(GSH)代谢循环的酶,GSH代谢异常多与细胞铁死亡发生相关。越来越多的研究表明GGCT在肿瘤中高度表达,并且GGCT的表达水平与肿瘤恶性程度相关。本研究主要探究GGCT在甲状腺乳头状癌中是否参与细胞铁死亡的过程,进一步的探究GGCT的上游及下游的调控机制,为甲状腺乳头状癌的发生发展机制探究提供理论支撑,同时为GGCT作为甲状腺乳头状癌诊断和治疗靶点提供理论基础。方法:利用免疫组织化学(IHC),实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)检测细胞和组织中目的基因的m RNA或蛋白表达水平;利用酶联免疫吸附法(ELISA)分析甲状腺乳头状癌患者手术根治术前或手术根治术后血清中GGCT的含量;利用免疫沉淀(IP)联合液相色谱-串联质谱技术(LCMS/MS)筛选与GGCT相互作用的蛋白;利用蛋白免疫共沉淀(Co-microbiome stabilityIP)实验和石蜡切片免疫荧光同源双标实验分析两蛋白之间的相互作用;利用双荧光素酶报告实验验证miRNA与靶基因的结合;利用慢病毒包装技术构建稳定敲降或过表达目的基因的细胞系;利用细胞活力试剂盒-8(CCK-8)、细胞克隆形成实验分析细胞的增殖能力;利用细胞伤口愈合实验和transwell实验分析细胞的迁移和侵袭能力;利用谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒检测细胞或组织中GSH水平;利用C11BODIPY 581/591探针结合流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测细胞中脂质活性氧(Lipid ROS)水平;利用丙二醛(MDA)脂质氧化水平检测试剂盒检测细胞或组织中MDA水平;利用透射电子显微镜观察线粒体的形态;利用裸鼠移植瘤模型研究目的基因对肿瘤细胞成瘤能力的影响;利用裸鼠肺转移模型评估目的基因对肿瘤细胞迁移和侵袭能Ferrostatin-1力的影响;利用H&E染色分析裸鼠肺部组织形成的肿瘤结节。结果:(1)GGCT负向调控甲状腺乳头状癌铁死亡的研究:GGCT在甲状腺乳头状癌组织及细胞系中高表达,甲状腺乳头状癌患者手术根治术24 h后血清中GGCT的含量显著降低。敲降GGCT在体内和体外抑制细胞的增殖、迁移和侵袭能力。铁死亡抑制剂可以逆转敲降GGCT引起的细胞活力下降,进一步的实验结果表明敲降GGCT抑制细胞内GSH的合成,促进MDA和ROS的积累,进而促进甲状腺乳头状癌细胞的铁死亡。(2)GGCT调控甲状腺乳头状癌细胞铁死亡的分子机制研究:IP联合LCMS/MS实验结果表明GGCT与RPS15A之间存在相互作用,RPS15A在甲状腺乳头状癌的组织及细胞中高度表达并且与GGCT的表达水平呈现正相关。敲降RPS15A后促进p53的表达,进而抑制SLC7A11的表达引起细胞铁死亡。过表达RPS15A逆转敲降GGCT引起的细胞铁死亡。(3)GGCT的上游调控机制研究:miR-205-5p在甲状腺乳头状癌中低表达,过表达miR-205-5p抑制GSH的合成,促进MDA和ROS的积累,促进细胞铁死亡。miR-205-5p通过靶向GGCT的3’UTR抑制GGCT的蛋白表达,过表达miR-205-5p在体内抑制GGCT介导的肿瘤生长和肺转移能力。结论:本研究发现GGCT在甲状腺乳头状癌中高表达,敲降GGCT促进细胞铁死亡进而抑制细胞的增殖、迁移和侵袭能力。机制上,GGCT与RPS15A之间存在相互作用,两者表达水平呈正相关。敲降RPSselleckchem15A促进p53的表达,抑制SLC7A11的表达,进而抑制GSH的合成。对GGCT调控的上游机制研究发现miR-205-5p在甲状腺乳头状癌中低表达,miR-205-5p通过靶向结合GGCT的3’UTR结合抑制GGCT的蛋白表达。过表达miR-205-5p在体内抑制GGCT介导的肿瘤生长和肺转移能力。