目的:最新研究数据显示,乳腺癌已成为目前全球发病率最高的恶性肿瘤,是女性最主要的死因之一。乳腺癌现有的常规治疗手段主要包括手术治疗,化疗,内分泌治疗,靶向治疗,免疫治疗及放疗等。这些治疗手段明显降低了乳腺癌患者的复发和死亡风险,使乳腺癌患者的预后得到了有效地改善。但仍有部分患者缺乏有效的治疗靶点,并且在药物治疗后可能出现肿瘤异质性,导致患者发生治疗耐药和肿瘤进展。乳腺癌增殖能力强和对药物治疗的耐药性等恶性生物学行为是导致患者疗效不佳,进展快且预后较差的关键因素。因此,寻找新的生物标志物用于预测乳腺癌患者预后,并探索新的治疗靶点用于乳腺癌治疗并克服肿瘤治疗耐药具有十分重要的意义。袢状核酸内切酶1(flap endonuclease 1,FEN1)是一种二价金属离子依赖的结构特异性的核酸酶,由N端结构域、中间结构域、C端结构域和一个扩展的C端结构域组成,具有核酸内切酶、5′-3’核酸外切酶和切口核酸内切酶三种生物学活性。FEN1通过在3’-flap附近形成疏水结构优先结合5’-flap结构,以此定位到flap结构底部,进行精准切割。因此,FEN1在冈崎片段的成熟、长片段碱基切除修复、端粒稳定性的维持、凋亡DNA降解及停滞复制叉的修复等多种DNA代谢途径中发挥着重要的作用。FEN1与肿瘤的发生发展也密切相关。既往多项研究发现,FEN1在肺癌、乳腺癌、胰腺癌及胃肠道肿瘤等多种恶性肿瘤组织中表达升高。FEN1过表达可以导致正常乳腺上皮细胞发生恶性肿瘤表型的转变。FEN1还可以促进肿瘤细胞增殖和细胞周期进展,抑制细胞凋亡,并降低肿瘤细胞对顺铂、替莫唑胺、紫杉醇及他莫昔芬等药物的敏感性。FEN1高表达可能提示肿瘤患者预后不良。这些结果表明,FEN1是恶性肿瘤进展中的关键作用分子,探究其在肿瘤中的功能和机制可能为肿瘤的防治和新药物的研发开拓新的思路。在乳腺癌中,FEN1可能是一种重要的生物标志物。但目前关于FEN1与乳腺癌的临床相关性研究尚未得出一致的结论。此外,尽管已有的研究表明,FEN1能够促进乳腺癌细胞的生长和增殖,并影响乳腺癌细胞对化疗的敏感性,但FEN1在乳腺癌细胞增殖和化疗耐药中的具体机制尚未完全明确。本研究旨在分析FEN1在乳腺癌中的预后价值和功能,通过筛选FEN1的相互作用蛋白,揭示FEN1在乳腺癌细胞增殖和化疗耐药中的作用机制。本研究明确了乳腺癌中新的预后标志物和治疗靶点,为乳腺癌增殖和耐药的机制研究提供了新的方向,并为未来制定新的乳腺癌治疗策略提供依据。研究方法:1.利用KM plotter在线数据库分析FEN1表达与无复发生存期(relapse-free survival,RFS)和总生存期(overall survival,OS)的关系;2.通过免疫组化实验分析乳腺癌患者组织芯片中FEN1表达与OS及各临床病理特征的相关性;3.下载肿瘤基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中的数据,分析FEN1表达与各临床病理因素的相关性;4.利用TCGA数据库中的数据,筛选FEN1表达的相关基因,通过京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome,KEGG)分析FEN1相关的功能和通路;5.通过免疫共沉淀结合质谱分析方法探索FEN1的相互作用蛋白,利用Networkanalyst在线网站构建蛋白相互作用网络;6.利用质谱分析中检测的FEN1的相互作用蛋白进行基因本体论(Gene Ontology,GO)分析和KEGG分析,分析FEN1的作用靶点和功能通路;7.利用免疫共沉淀(immunoprecipitation,IP)实验验证FEN1与TATA元件调节因子1(TATA element–modifying factor 1,TMF1)的相互作用;8.利用免疫荧光实验检测FEN1与TMF1在细胞内的共定位;9.通过免疫组化实验分析乳腺癌患者组织芯片中FEN1表达与TMF1表达的相关性;10.利用q RT-PCR实验和Western bEmbryo biopsylot实验检测TMF1和FEN1的表达情况及si RNA和过表达质粒的转染效率;11.利用GEPIA2和UALCAN在线数据库分析TMF1的表达情况;12.利用KM plotter在线数据库分析TMF1表达与RFS、OS和无远处转移生存期(distant metastasis-free survival,DMFS)的关系;13.通过免疫组化实验分析乳腺癌患者组织芯片中TMF1的表达情况,及TMF1表达与患者OS的相关性;14.利用TCGA数据库中的数据,通过GSEA功能富集分析TMF1相关的功能和通路;15.利用MTS实验检测乳腺癌细胞活力;16.利用集落形成实验检测乳腺癌细胞增殖能力;17.利用Western blot实验检测FEN1及TMF1沉默或过表达后ERK和磷酸化ERK的蛋白表达情况;18.利用Western blot实验检测敲减FEN1及顺铂处理后p62、、LC3B I、LC3B II、TOM20、TIM23和Cleaved Caspase 3等蛋白的表达情况;19.裸鼠皮下成瘤实验验证FEN1和TMF1对乳腺癌细胞体内生长的作用;20.通过GFP-m Cherry-LC3免疫荧光实验检测敲减FEN1后细胞中自噬流的变化;21.通过GST pull-down实验验证FEN1与Beclin 1之间的结合;22.通过mt-Keima荧光方法检测损伤线粒体的清除情况;23.利用TMRM法通过流式细胞术实验检测线粒体的膜电位情况;24.利用DCFH-DA染色方法通过流式细胞术实验检测线粒体活性氧(reactive oxygen species,ROS)的水平;25.通过免疫荧光法检测细胞核中γH2AX的聚集,判断DNA损伤情况;26.流式细胞术实验检测顺铂处理后的细胞凋亡情况;27.利用Graph Pad Prism软件(V 8.0.2)和SPSS 24.0软件进行统计学分析。使用Student’s-t检验和one-way ANOVA方法进行两组或多组间比较。P<0.05被认为具有统计学意义。结果:第一部分:1.FEN1高表达的乳腺癌患者预后不良。在线数据分析表明FEN1 m RNA高表达的乳腺癌患者RFS和OS较差。同时通过免疫组化的方法分析乳腺癌患者组织中FEN1的蛋白表达水平,生存分析结果提示FEN1高表达与患者OS较短相关,且进一步的多因素分析表明FEN1高表达是乳腺癌患者OS的独立预后不良因素;2.FEN1高表达与乳腺癌患者肿瘤较大及分期晚等侵袭性特征相关。乳腺癌患者组织芯片分析结果显示FEN1蛋白表达与年龄、分期、淋巴结转移及分子分型等临床特征无显著的相关性。而利用TCGA数据进行的相关性分析结果提示FEN1 m RNA水平高表达与乳腺癌患者肿瘤大小和疾病分期显著相关;3.FEN1与乳腺癌细胞增殖和生长信号调控相关。在TCGA数据集中筛选与FEN1表达相关的基因进行KEGG功能富集分析发现,这些基因在细胞周期、细胞衰老和p53信号等通路显著富集。此外,利用TCGA表达谱数据进行GSVA分析发现,FEN1表达与肿瘤增殖、DNA修复、G2/M检查点、MYC信号及DNA复制通selleck抑制剂路显著正相关;4.FEN1可能参与乳腺癌中细胞自噬过程。通过免疫共沉淀结合质谱分析的方法筛选出了FEN1潜在的相互作用蛋白,并构建了FEN1相关蛋白相互作用图谱。对这些潜在的相互作用蛋白进行GO分析和KEGG分析发现,FEN1与细胞内吞、吞噬体、自噬、内质网蛋白质加工和抗原加工呈递等生物学过程相关。第二部分:1.乳腺癌细胞中FEN1与TMF1存在相互作用。免疫共沉淀结合质谱分析结果提示TMF1可能是FEN1的相互作用蛋白。在乳腺癌细胞株中通过IP实验验证了TMF1是FEN1的相互作用蛋白。同时,应用免疫荧光实验观察到了FEN1与TMF1在乳腺癌细胞内的共定位;2.免疫组化实验结果显示在乳腺癌患者组织中FEN1与TMF1的表达Q-VD-Oph抑制剂呈显著的正相关;3.FEN1上调TMF1的蛋白水平表达。利用si RNA下调TMF1表达后,FEN1的m RNA和蛋白表达无明显变化。而沉默FEN1后,TMF1的m RNA水平无明显变化,蛋白水平表达明显下降。反之过表达FEN1后,TMF1的蛋白表达明显增加;4.FEN1可以维持TMF1的蛋白稳定性。沉默FEN1后,TMF1的蛋白降解速率明显加快;5.FEN1抑制了溶酶体介导的TMF1蛋白降解。下调FEN1引起的TMF1蛋白表达减低可以被氯喹二磷酸盐(chloroquine diphosphate salt,CQ)逆转,而蛋白酶体抑制剂MG132则没有表现出这种逆转作用;6.在线数据分析结合乳腺癌患者组织免疫组化实验分析发现,TMF1在乳腺癌中的表达水平显著高于正常乳腺组织,且TMF1高表达与乳腺癌患者预后不良相关;7.FEN1通过稳定TMF1促进乳腺癌细胞增殖。沉默TMF1后,乳腺癌细胞增殖能力受到抑制。反之,过表达TMF1后,乳腺癌细胞增殖能力增强。且沉默TMF1能够抑制FEN1对乳腺癌细胞增殖的促进作用;8.TMF1通过激活MEK/ERK信号通路促进乳腺癌细胞增殖。下调TMF1表达后,p-ERK水平降低,反之过表达TMF1后,p-ERK表达水平升高。MEK1/2抑制剂PD98059可以逆转TMF1导致的乳腺癌细胞增殖能力增强;9.FEN1通过TMF1激活MEK/ERK信号通路。过表达FEN1后,乳腺癌细胞中p-ERK水平升高,同时下调TMF1表达后,p-ERK水平则明显降低。沉默TMF1逆转了FEN1导致的MEK/ERK信号激活;10.FEN1通过TMF1促进乳腺癌细胞体内生长。裸鼠皮下成瘤实验显示,过表达FEN1的肿瘤体内增殖速度明显更快,体积更大,重量更重。同时沉默TMF1后,肿瘤增殖速度减慢,体积减小,重量也减轻。第三部分:1.沉默FEN1能够抑制顺铂诱导的乳腺癌细胞自噬水平。敲减FEN1抑制了顺铂诱导的p62的蛋白降解和LC3B II型的增加。并且,GFP-m Cherry-LC3免疫荧光实验结果表明,在顺铂作用下同时沉默FEN1,细胞中自噬体及自噬溶酶体数量均明显减少;2.FEN1通过竞争性结合Beclin 1的BH3结构域,阻断了Bcl-2对Beclin 1的抑制作用。GST pull-down实验表明乳腺癌细胞中FEN1与Beclin 1直接结合,且在顺铂作用下,FEN1与Beclin1的结合增强。在缺失了BH3结构域后,FEN1与Beclin 1的结合明显较弱。在顺铂作用下,沉默FEN1后Beclin 1与Bcl-2的结合则明显增强;3.FEN1通过介导线粒体自噬清除线粒体损伤,维持细胞内的线粒体稳态。在顺铂作用下,沉默FEN1后乳腺癌细胞内损伤线粒体的清除减少,线粒体特异性蛋白TOM20和TIM23表达增加,细胞内低电位受损线粒体数量明显增加;4.FEN1介导的线粒体自噬参与了细胞内氧化还原稳态的维持。在顺铂作用下,沉默FEN1导致乳腺癌细胞内ROS水平明显升高;5.FEN1介导的自噬抑制顺铂诱导的DNA损伤和细胞凋亡。在顺铂作用的情况下,沉默FEN1后细胞核内γH2AX聚集明显增加,Cleaved Caspase 3表达升高,凋亡细胞数量也明显增加。结论:1.FEN1高表达是乳腺癌患者的预后不良因素,与乳腺癌侵袭性表型相关;2.FEN1可能通过调控乳腺癌细胞增殖和自噬等过程影响乳腺癌进展;3.FEN1通过TMF1激活MEK/ERK信号通路,从而促进乳腺癌细胞增殖;4.FEN1通过Beclin1调节细胞自噬,介导乳腺癌顺铂耐药。