背景:红细胞膜相关蛋白(Erythrocyte membrane-associated protein,ERMAP)与现有的免疫检查点分子具有序列和结构上的相似性,被认为是一种B7家族相关分子且与嗜乳脂蛋白(Butyrophilins,BTN)家族具有序列同源性,包含细胞外免疫球蛋白结构域IgV,跨膜区及细胞内的B30.2结构域。ERMAP融合蛋白可通过抑制自身反应性T细胞增殖和激活,调节巨噬细胞向M2极化,改善实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,EAE)和 Ⅰ 型糖尿病(type Ⅰ diabetes mellitus,T1D)。炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一组以胃肠道慢性炎症为特征的疾病,T细胞的过度激活和M1/M2型巨噬细胞数量的不平衡会加重IBD的发展。Ml型巨噬细胞在疾病发展期促进炎症反应,M2型巨噬细胞促进调节性T细胞(Regulatory T cells,Tregs)增殖产生抗炎作用,并参与损伤后的组织恢复。而ERMAP是否参与炎症性肠病的发生发展尚未可知,因此本课题探究ERMAP融合蛋白在炎症性肠病中的作用机制。目的:本课题探究ERMAP对葡聚糖硫酸钠(Dextran Sodium Sulfate,DSS)诱导的小鼠(C57BL/6)结肠炎的影响及其对巨噬细胞极化和T细胞反应的影响。方法:1、ERMAP-Ig对小鼠IBD的改善作用:取30只正常C57BL/6小鼠喂食3%的DSS溶液建立IBD模型,将小鼠分为2组:对照蛋白组(DSS+Control Ig)和ERMAP融合蛋白组(DSS+ERMAP-Ig)(n=12)。(1)从建模第0天开始疾病活动指数(Disease Activity Index,DAI)评分及体重测量,第3,6,9天腹腔注射(intraperitoneally,i.p.)ERMA确认细节P-Ig 或 Control Ig,并于建模后的第 12 天取结肠进行苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-Eosin staining,HE)染色及免疫荧光染色。(2)用两组小鼠的结肠提取结肠固有层细胞,用抗-F4/80/MHC-Ⅱ/CD206抗体染色检测巨噬细胞比例;抗-CD4/CD25/Foxp3染色检测Tregs 比例变化。(3)制备各组小鼠的脾脏单细胞悬液,用抗-F4/80/MHC-Ⅱ/CD206染色检测巨噬细胞比例;用抗-CD4/CD8/CD69/Ki67/CD25/Foxp3检测细胞活化、增殖及Tregs的比例;用抗-CD3或抗-CD28刺激3天后,于第四天提前4-6 h加入PMA/BFA/离子霉素刺激,FACS检测细胞因子TNF-α的表达情况;用抗-CD3或抗-CD28刺激5天后,CFSE染色检测T细胞的增殖情况。(4)结肠和脾脏的单细胞悬液在PMA/BFA/离子霉素刺激下培养6h,流式染色检测CD4+细胞中TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-17A的表达。(5)取各组小鼠血清ELISA检测细胞因子TGF-β1、IL-6的含量。(6)取各组小鼠的结肠,Western Blot 检测 NLRP3、GSDMD、Caspase1、IL-1β的蛋白表达,qRT-PCR 检测 Arg-1、CD206、iNOS、NLRP3、GSDMD、Caspase1、IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ、TGF-β1、IL-4、IL-10 等基因表达情况。2、体外干扰巨噬细胞系RAW264.7上ERMAP的表达,探究其对巨噬细胞极化及其对T细胞活化的影响:(1)慢病毒干扰RAW264.7上ERMAP的表达,在M1及M2的分化条件下分别培养,流式检测巨噬细胞的分型。(2)提前用抗-CD3包被板(5 μg/mL),将慢病毒干扰的细胞与C57BL/6小鼠脾细胞共培养,16小时后收集细胞检测细胞活化指标CD69,72小时后收集细胞检测细胞增殖指标Ki67。(3)细胞活化后加入PMA/BFA/离子霉素刺激6 h,流式检测CD4+细胞中 TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-17A 的表达。(4)RAW264.7 与 ERMAP shRNA RAW264.7进行测序分析,并通过qRT-PCR检测相关基因的表达。3、过继转移模型探究ERMAP-/-巨噬细胞对IBD的影响:WT小鼠(每组6只)在第-1天和第-2天通过腹腔注射100 μL氯膦酸钠脂质体清除体内巨噬细胞。第0天,WT小鼠移植来自WT或ERMAP-/-小鼠的腹腔巨噬细胞M0(每只小鼠1.0×106个)。巨噬细3-Methyladenine体内胞转移12小时后DSS诱导结肠炎。每日进行DAI评分及体重测量,第9天安乐死小鼠后取材。(1)取结肠进行HE染色。(2)制备各组小鼠的脾脏单细胞悬液,用抗-CD4/CD8/CD69/Ki67/CD25/Foxp3检测细胞活化、增殖及Tregs的比例,(3)qRT-PCR检测结肠中的炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-23、IFN-γ、TNF-α、TGF-β。结果:1、ERMAP-Ig融合蛋白作用小median filter鼠IBD模型研究结果:(1)与Control Ig组相比,ERMAP-Ig可有效减轻IBD小鼠的临床症状,降低DAI评分。组织病理学染色结果表明DSS诱导后Control Ig小鼠中炎症细胞浸润,上皮破坏严重和隐窝损失,在ERMAP-Ig小鼠中,这些特征得到改善。(2)ERMAP-Ig处理组中,小鼠结肠及脾脏中M2型巨噬细胞增多,M1型减少,CD4+CD25+FoxP3+Tregs增加,脾脏中CD4+CD69+及CD8+CD69+T细胞活化比例下降,CD4+Ki67+和CD8+Ki67+T细胞增殖比例减少,CFSE增殖实验表明CD4+T细胞减少。(3)ERMAP-Ig治疗后,TNF-α+巨噬细胞减少。ERMAP-Ig确实可改善DSS诱导的小鼠结肠炎症状。(4)ERMAP-Ig组的结肠和脾脏CD4+T细胞中Th2(IL-4+)细胞增加,致病性 Th1(IFN-γ+、TNF-α+)和 Th17(IL-17A+)细胞减少。(5)取 IBD 小鼠外周血清发现,与Control Ig处理组相比,ERMAP-Ig组中炎性细胞因子IL-6、TGF-β1明显减少。(6)在DSS诱导的IBD模型中,ERMAP-Ig组小鼠结肠组织中NLRP3、GSDMD、Caspase1、IL-1β蛋白含量均较Control Ig低,且差异具有统计学意义。(7)qRT-PCR检测ERMAP-Ig组结肠中高表达M2型巨噬细胞标志物Arg-1和CD206,低表达iNOS;与Control Ig组相比,结肠组织焦亡小体GSDMD等上下游基因相对表达均较ERMAP-Ig组高;炎性因子IL-6、TNF-α、IFN-γ和TGF-β1在ERMAP-Ig组均降低,而抑炎因子IL-4、IL-10表达增加。2、干扰RAW264.7中的ERMAP抑制M2型巨噬细胞极化及促进T细胞反应:(1)慢病毒干扰巨噬细胞系RAW264.7,在M1的分化条件下,与未处理的RAW264.7及对照病毒组比较,干扰ERMAP使MHCⅡhiCD206loM1型巨噬细胞增加;M2分化条件下,干扰ERMAP使MHCⅡloCD206hiM2型巨噬细胞增加。(2)将ERMAP shRNARAW264.7与C57BL/6小鼠脾细胞共培养发现ERMAP干扰的巨噬细胞使CD4+CD69+及CD8+CD69+的活化T细胞增多,CD4+Ki67+及CD8+Ki67+T细胞增殖增加。(3)与干扰ERMAP的巨噬细胞共培养使CD4+脾细胞中 Th1(TNF-α+、IFN-γ+)和 Th17(IL-17A+)比例增加。(4)RNA-seq筛选出了可能与ERMAP影响巨噬细胞功能的NOD-like recepter相关信号通路,qRT-PCR验证了焦亡相关基因与ERMAP相关。3、ERMAP-/-巨噬细胞加重DSS诱导的WT小鼠结肠炎:(1)给予ERMAP-/-巨噬细胞(KOMφ)的小鼠显著增加了第5天到第9天的DAI评分。(2)组织病理学分析显示,与给予WT巨噬细胞(WTMφ)相比,KOMφ显著增加了经DSS诱导的结肠炎小鼠的结肠损伤。(3)第9天取两组小鼠的脾脏进行流式分析,发现KOMφ组小鼠的Tregs较WTMφ更低。(4)WT+KOMφ小鼠的脾脏T细胞活化和增殖均较WT+WTMφ组小鼠增加,说明敲除ERMAP的巨噬细胞促进T细胞的增殖活化。(5)WT+KOMφ小鼠的结肠中表达更多的炎性因子IL-1β、IL-6、IL-23、IFN-γ、TNF-α、TGF-β。结论:1、ERMAP-Ig可改善DSS诱导的小鼠结肠炎症状及炎症反应。2、ERMAP-Ig增加结肠M2型巨噬细胞的数量。3、ERMAP-Ig抑制IBD小鼠脾脏T细胞反应及促进巨噬细胞向M2极化。4、干扰RAW264.7中的ERMAP抑制M2型巨噬细胞极化及促进T细胞反应。5、过继转移ERMAP-/-巨噬细胞加重DSS诱导的WT小鼠结肠炎。