目的评估钙调素抑制剂DY98对右侧颈总动脉永久性结扎诱导血管性痴呆(Vascular Dementia,Va D)模型小鼠的认知功能障碍的改善作用,并基于星形胶质细胞的炎症反应,阐明DY98对血管性痴呆模型小鼠的认知功能障碍的改善作用机制。方法1.评估DY98对Va D模型小鼠的认知功能障碍的改善作用,及基于星形胶质细胞探讨DY98的改善作用机制将购买的SPF级别雄性C57BL/6J小鼠适应性饲养七天后,随机分成5组,每组10只。通过结扎C57BL/6J小鼠的右侧颈总动脉(r UCCAO),造成小鼠慢性脑血流灌注不足,模拟Va D病灶。假手术(Sham)组和r UCCAO组均给予0.5%的CMC-Na、阳性对照组给予盐酸多奈哌齐(Donepezil)、给药组给予DY98(5 mg/kg)和DY98(1 mg/kg)进行灌胃。钝性分离小鼠的右侧颈总动脉,除了不进行颈动脉结扎手术,其他操作与其手术组相同,给予生理盐水灌胃,作为假手术组。连续给药72天后取材检测相关指标。(1)采用Y迷宫、Morris水迷宫行为学实验检测小鼠的学习和Canagliflozin分子式记忆功能。(2)运用免疫荧光(Immunofluorescence,IF)对Va D模型小鼠大脑内星形胶质细胞与IL-1β、GSDMD等炎性蛋白进行共定位,并采用实时荧光定量q PCR(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,q PCR)检测小鼠右侧海马中的Caspase-1和GSDMD焦亡蛋白的m RNA水平。2.探讨DY98对LPS/ATP诱导星形胶质细胞发生焦亡的作用及作用机制星形胶质细胞给予LPS/ATP进行诱导,构建C8-D1A星形胶质细胞焦亡炎症模型,然后分别给予无菌水、米诺环素(Minocycline)10μM、DY98 1μM进行给药,对照组给予与模型组等量无菌水。(1)MTT实验检测不同浓度DY98,在给予LPS/ATP诱发星形胶质细胞发生焦亡后,对细胞存活率的影响。(2)细胞形态学分析DY98对LPS/ATP诱导星形胶质细胞发生焦亡后的细胞形态变化。(3)采用蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)、IF检测IL-1β、Caspase-1、GSDMD、NLRP3蛋白的表达情况,并运用q PCR检测其m RNA水平。结果1.在DY98和Donepezil的灌胃给药下,r UCCAO术后的C57BL/6J小鼠在Y迷宫实验中,自发交替正确率有明显提升,而不做任何治疗的r UCCAO模型小鼠的自发交替正确率明显下降,均具有统计学意义。同时,在Morris水迷宫实验中发现,r UCCAO组的小鼠在第五天在撤掉平台的情况下进行空间探索时,小鼠在45 s内未能找到平台的位置,其他组别的小鼠均能找composite biomaterials到平台的位置。此外,与Sham组小鼠相比,r UCCAO模型组小鼠的逃避潜伏期明显延长,而给予DY98和Donepezil灌胃给药后,小鼠的逃避潜伏期有所缩短。同时,与Sham组小鼠比较,r UCCAO组小鼠穿越平台次数明显减少,具有统计学差异。与r UCCAO模型组小鼠比较,DY98和Donepezil组小鼠的穿越平台次数明显提高,具有统计学意义。通过Y迷宫和水迷宫实验结果,提示DY98可以改善Va D模型小鼠的学习和记忆功能障碍。2.通过免疫荧光实验和q PCR实验探讨DY98的初步作用机制,对各组小鼠脑组织中的星形胶质细胞与炎性蛋白进行共定位染色观察发现,与Sham组小鼠比较,r UCCAO小鼠的GFAP和IL-1β等炎性蛋白的荧光强度有所增强,结果提示,r UCCAO术后引起的认知功能障碍可能与星形胶质细胞发生炎症反应有关。q PCR实验结果显示,与Sham组小鼠比较,r UCCAO组小鼠海马中的IL-1β、GSDMD和Caspase-1等炎性蛋白的m RNA水平上调,具有统计学差异。而与r UCCAO组小鼠比较,给予DY98和Donepezil分别灌胃给药的小鼠,上述炎性蛋白的m RNA水平表达下调,并具有统计学意义。结合免疫荧selleck CB-839光共定位实验和q PCR实验结果,提示DY98改善r UCCAO小鼠的学习记忆功能障碍与改善星形胶质细胞的炎症反应有关,并与焦亡途径相关联。3.MTT检测结果显示,给予LPS/ATP造模后,星形胶质细胞的存活率下降,与正常组细胞相比,具有统计学意义。提前3 h给予DY98后再进行造模,DY98浓度为1μM和500 n M时,星形胶质细胞的存活率有所提高,与LPS/ATP模型组相比,具有统计学差异。同时,由细胞形态学分析结果表明,在正常状态下的C8-D1A星形胶质细胞呈星形状,细胞间的突起伸展分布且连接紧密。经过LPS/ATP造模后的C8-D1A细胞肿胀、变圆,突起断裂,细胞间大多数呈单个散落状态。而给予MINO和DY98组的细胞未见明显的胀圆,突起分支连接相对紧密。结果提示DY98可以减轻LPS/ATP诱导的星形胶质细胞发生焦亡。4.采用WB、IF及q PCR实验对作用机制进行多重验证,发现这三者的实验结果均吻合。与正常组组比较,LPS/ATP模型组的IL-1β、Caspase-1、GSDMD、NLRP3等炎性蛋白的表达和相对应的m RNA水平明显上调,均具有统计学差异。而相对于LPS/ATP模型组,给予DY98和Minocycline给药的组别,IL-1β、Caspase-1、GSDMD、NLRP3等炎性蛋白的表达和相对应的m RNA水平明显下调,均具有统计学差异。结果提示,DY98可抑制LPS/ATP诱导星形胶质发生细胞焦亡引起的炎症反应。结论本研究结果发现,DY98与Donepezil均可改善Va D模型小鼠的学习和记忆功能障碍,可能与抑制星形胶质细胞发生焦亡缓解炎症反应有关。通过LPS/ATP诱导的星形胶质细胞发生焦亡炎症模型,发现DY98具备与MINO相似的药理功效,具有较强的消炎作用,可抑制星形胶质细胞发生焦亡,缓解神经炎症的发生,并可能是通过阻止NLRP3介导的经典焦亡通路发挥作用。由此,DY98有望会成为Va D疾病的潜在治疗药物,且NLRP3介导的经典焦亡途径可能是一个新的治疗靶点。