研究背景与研究目的脓毒血症(sepsis)被定义为机体对感染反应失调引起的危及生命的器官功能障碍,目前尚无有效治疗手段和药物,严重危害人类健康。巨噬细胞作为重要的固有免疫细胞,是维持机体免疫稳态的重要组成。巨噬细胞表达多种模式识别受体,在脓毒血症中发挥重要作用。发现巨噬细胞的新的调控分子,揭示脓毒血症的发病机制,寻找有效干预靶点具有重要意义。Ras 家族的鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(The Rho family of small GTP-binding proteins,Rho-GTPases)作为细胞信号传导中的重要分子开关,通过结合GTP或GDP而在活性与非活性状态之间进行转换,在多种细胞生命活动中发挥关键调控作用。鸟嘌呤核苷酸交换因子(guhttps://www.selleck.cn/products/AZD1152-HQPA.htmlanine nucleotide exchange factor,GEF)家族成员促进 GTP 与 GDP 转换,保证Rho-GTPases能够在特定空间和时间激活,是Rho-GTPase发挥活性的重要调节因子。研究表明,多种GEF参与调控巨噬细胞内吞及早期内体的囊泡运输。DENN结构域蛋白可以发挥GEF的功能。Dennd1A(DENN domain containiDibutyryl-cAMPng 1A)是一种包含DENN(Differentially Expressed in Neoplastic versus Normal cells 肿瘤细胞与正常细胞的差异表达)结构域的蛋白,在多种组织广泛表达。Dennd1A缺失影响肝脏、原始生殖细胞及血细胞发育,但其对巨噬细胞及炎症的影响,迄今尚未见报道。本论文利用条件性敲除小鼠,研究Dennd1A对巨噬细胞功能及脓毒血症的调控作用。研究方法与研究结果1.Dennd1A在巨噬细胞中高表达为确定Dennd1A调控巨噬细胞的可能性,我们首先通过qPCR的方法检测了Dennd1A在各免疫细胞中的表达,发现其在巨噬细胞中高表达。2.敲除Dennd1A促进巨噬细胞表达炎性因子为研究Dennd1A在巨噬细胞免疫调控中的作用,我们构建了髓系细胞Dennd1A特异性敲除(Lyz2-iCre+/-Dennd1A flox/flox,MKO)小鼠和对照(Dennd1Aflox/flox,WT)小鼠,并验证了 Dennd1A在巨噬细胞的敲除效率。分离上述小鼠腹腔巨噬细胞,分别进行LPS、IL-4、Poly I:C刺激,荧光定量和ELISA检测细胞因子的表达。结果显示,在LPS和Poly I:C刺激下,敲除Dennd1A小鼠的巨噬细胞炎性因子表达明显增加。3.巨噬细胞特异性Dennd1A敲除显著促进小鼠脓毒血症的炎症反应为进一步在体内研究Dennd1A调控巨噬细胞的作用,对MKO小鼠及WT小鼠分别进行LPS注射或盲肠穿刺结扎,构建脓毒血症模型。动物死亡曲线统计结果发现,巨噬细胞敲除Dennd1A后,LPS处理和盲肠穿刺结扎小鼠的死亡率显著上升、死亡时间提前。肺组织切片染色和RT-PCR检测结果显示,MKO小鼠的肺组织出现坏死情况且IL-6等炎性因子表达明显升高。ELISA结果证实,MKO小鼠血清中IL-6表达显著升高。4.Dennd1A缺失不影响巨噬细胞吞噬作用为研究Dennd1A对巨噬细胞吞噬作用的影响,使用MKO小鼠的腹腔巨噬细胞进行荧光微球吞噬实验。流式细胞术检测和荧光显微镜观察统计发现,Dennd1A敲除后巨噬细胞的吞噬能力没有显著变化。5.Dennd1A抑制巨噬细胞TLR4通路为研究Dennd1A抑制巨噬细胞炎性因子表达的作用机制,我们利用流式细胞术、荧光定量RT-PCR和western blot等实验检测巨噬细胞表面受体内吞及TLR4下游信号分子,发现Dennd1A敲除巨噬细胞TLR4下游信号通路被抑制。研究结论与意义本研究首次证明了 Dennd1A抑制巨噬细胞炎症反应、减缓脓毒血症的作用,发现了 Dennd1A的新的生物学功能,同时为阐明脓毒血症调节机制提供了新的实验数据,Dennd1A调控巨噬细胞炎症反应的分子机制及其在炎症相关疾病中的作用还有SARS-CoV2 virus infection待进一步研究。