背景:在细菌感染急性期的病理过程中,炎症的转归是消退还是扩大,不仅是机体和入侵病原体动态博弈的过程,也是一系列复杂免疫调控的结果,但是上述机制尚未得到充分阐明。本课题旨在寻找新的急性炎症相关分子,完善炎症调控机制理论,探索潜在治疗靶点。树突状细胞来源干扰素γ诱导蛋白(dendritic cell-derived interferon-gamma induced protein,DCIP)是本实验室团队于2000年在首次在人类树突状细胞中克隆并鉴定的天然免疫相关蛋白,已有研究证实,DCIP具有如下功能:1.抵御肿瘤和某些自身免疫性疾病;2.参与了抗多种病毒的免疫应答;3.维持细胞基因组的稳定。上述功能的发挥,均同其脱氧核苷三磷酸酶(d NTPase)活性相关,即将d NTP(Deoxyribonucleoside triphosphates)水解为d Ns(脱氧核苷)和PPPi(三磷酸基团)的能力。另外,人源DCIP有一个被认为和抗病毒活性有关的磷酸化位点T592,细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin dependent kinase,CDK)调控该位点的磷酸化,但其是否影响DCIP的d NTP酶活性尚存在争议。在鼠源DCIP与T592对应的同源磷酸化位点为T634,但是对于T634磷酸化是否同样影响DCIP的抗病毒功能目前尚不明确。尽管目前针对DCIP在抗病毒、抗自身免疫和抗肿瘤等方面的研究相对较为深入,但是其是否具有抗细菌感染性炎症的免疫功能及其详细机制,目前尚未有相关报道。本课题的预实验结果表明,在LPS刺激的野生型小鼠巨噬细胞中,DCIP的表达呈时间相关性先升高后降低,提示其可能参与了炎症的天然免疫调控,因此我们决定对其开展进一步研究。方法:我们利用Cas9基因编辑技术,分别构建了髓系Dcip条件性敲除(Dcip~(-/-))小鼠品系和Dcip~(-/-)RAW264.7小鼠巨噬细胞系作为本课题的研究模型,以评估DCIP在LPS诱导急性炎症中的作用。另外,我们构建了全长野生型鼠源DCIP的真核表达载体,并在此基础上构建了如下突变体:1.使DCIP的d NTP酶失活的突变体H238A/D239A;2.使T634位点磷酸化缺失的突变体T634A;3.使T634位点模拟磷酸化的突变体T634D。通过将上述全长DCIP或DCIP突变体在Dcip~(-/-)RAW264.7细胞内过表达并观察表型回复,进一步明确DCIP在急性炎症中的功能,以及在这一过程中,d NTP酶活性和T634磷酸化位点的影响。结果:体内实验结果,腹腔注射LPS的Dcip~(-/-)小鼠相比于对照小鼠血清中IL-6、TNFα、乳酸等炎症因子水平更高;HE染色显示,Dcip~(-/-)小鼠肺组织内有更多炎性细胞浸润,伴有肺泡腔狭窄,肺泡壁增厚等病理特征。在致死量LPS注射下,Dcip~(-/-)小鼠相比于对照小鼠,在60小时观察时间内的存活率显著降低。体外实验结果,LPS刺激的Dcip~(-/-)腹腔巨噬细胞相比于对照细胞表达更高水平的IL-6、TNFα、IFNβ,对LPS-TLR4通路上的关键蛋白总量和磷酸化水平进行检测,发现Dcip~(-/-)腹腔巨噬细胞的TLR4通路活化更显著;在经过M1极化诱导后,Dcip~(-/-)腹腔巨噬细胞相比对照细胞有更高的M1极化比例;另外,在静息和M1极化诱导状态下,Dcip~(-/-)巨噬细胞的线粒体膜电位降低,线粒体来源ROS升高,线粒体有氧呼吸受抑制,而糖酵解代偿性增加。尽管Dcip~(-/-)巨噬细胞的线粒体功能受损,但是并未观察到显著的细胞凋亡,在静息状态的Dcip~(-/-)巨噬细胞中,观察到了线粒体自噬,而对照细胞则无此表型。在Dcip~(-/-)RAW264.7中分别转染全长野生型DCIP及其突变载体,用LPS刺激后检测细胞的IL-6分泌,或诱导细胞向M1极化后,分别检测细胞的膜电位水平、M1细胞极化比例。结果表明,DCIP能够抑制炎症因子分泌、维持线粒体膜电位和抑制细胞的M1极化,上述功能依赖于DCIP的d NTP酶活性,并且受到磷酸化位点T634的调控。最后,我们探索了DCIP调控线粒体功能的潜在互作分子。co-IP和使用激光共聚焦显微镜的免疫荧光共定位分析证实DCIP与电压依赖性阴离子通道1(Voltage Dependent Anion Channel 1,VDAC1)存在相互作用。VDAC1是一个定位于线粒体外膜的通道蛋白,能够转运多种物质通过线粒体外膜,因此可能参与到DCIP介导的线粒体内dNTP池调控,从而影响线粒体基因组的稳定。VDAC1寡聚化将使线粒体外膜上形成孔洞,使细胞色素c泄露至胞浆引发细胞凋亡。另外有研究表明,Pink1-Parkin通路介导的VDAC1泛素化可招募蛋白p62和LC3B,形成线粒体自噬。因此,DCIP-VDAC1相互作用可能通过上述机制影响线粒体的状态。IP联用蛋白鉴定质谱的结果提示,内质网脂筏相关蛋白1(ER Lipid Raft Associated 1,ERLIN1)也和DCIP存在相互作用。在细胞内存一种叫做“线粒体相关内质geriatric oncology网膜”(Mitochondrial Associated ER Membrane,MAM)的微观结构,是内质网和线粒体进行物质运输和信号转导的部位,而内质网脂筏是MAM的组成之一。ERLIN1作为内质网脂筏上的关键蛋白,帮助稳定了MAM,同时ERLIN1被证实通过和AMBRA1、VDAC1的相互作用,调控线粒体自噬。我们的研究结果表明,DCIP和ERLIN1、VDAC1同时存在互作,提示其可能通过MAM结构调控线粒体的功能。结论:本课题发现了LPS-TLR4信号传导新的调节PR-171 IC50机制,DCIP通过与VDAC1、ERLIN1等分子的相互作用,维持线粒体功能、抑制LPS-TLR4通路诱导的急性炎症和巨噬细胞BIBW2992溶解度M1极化。