着丝粒是染色体重要的组成部分,由内部的着丝粒DNA及组蛋白和外部的动粒蛋白复合体组成,其在细胞的有丝分裂和减数分裂过程中,参与染色体的分离和传递。着丝粒区域往往由大量的串联重复序列和转座子重复序列组成。由于异染色质化,着丝粒区的遗传重组及转录活性通常会受到显著抑制,有研究认为着丝粒区域不存在有功能的基因。随着高通量测序技术的深入发展,越来越多的研究发现水稻等的着丝粒区域存在具有转录活性的基因,但这些基因的生物学意义及功能尚未有深入研究。本研究旨在建立基于CRISNirmatrelvirPR/Cas9的基因组编辑系统的规模化分析和突变体鉴定流程,为加速水稻着丝粒区域基因的功能研究奠定基础。本研究的主要结果如下:1.着丝粒区域基因的获取和分析根据已发表的籼稻明恢63(MH63FUT-175体内)的无缺口参考基因组和着丝粒区域信息,首先从MH63的基因组中提取出着丝粒区域基因的序列,并进一步通Oil remediation过BLAST序列比对、功能注释、RNA-seq分析和RT-PCR验证,筛选出148个在着丝粒区域中进化保守且可能执行重要功能的基因。2.基因编辑载体PRGE32的改造为了监测农杆菌侵染愈伤的效率和方便分离Cas9-free的突变体家系,我们在PRGE32载体中插入了报告基因RUBY,构建出PRGE32-Ruby载体。同时,为实现高效、精确的农杆菌混合转化和突变体鉴定,本研究构建了12个具有长度序列多态性的DNA片段作为标签的PRGE32-Ruby载体PRGE32-Ruby V_0-V_(11)。3.sgRNAs的设计和验证本研究使用Flash Fry批量设计了MH63着丝粒区域基因的CRISPR/Cas9敲除靶点,基于软件的评分算法和人工筛选手段,最终确定95个基因的单敲除靶点。构建并验证了95个基因的CRISPR敲除载体,以6个携带不同靶点的CRISPR载体为一组进行农杆菌介导的混合转化。4.敲除载体的遗传转化、T_0代转化苗的靶点鉴定和基因分型本研究一共进行了20次遗传转化,并获得2000多个T_0代转基因株系。本研究利用深度靶向测序技术(Hi-TOM)对1053株转化苗进行了靶点鉴定,在716株转化苗中获取到52个目标基因的靶点信息。进一步利用Hi-TOM技术对116株已知sgRNA序列的转化苗进行了基因分型,鉴定出14个目标基因的突变体,总的基因编辑效率为77.6%,且目标基因发生的突变类型主要为移码突变。综上,本研究建立了包括着丝粒区域基因的筛选和分析、sgRNA的批量筛选与设计、载体混合转化和突变体材料的鉴定等相关流程,从而获得了大量着丝粒区域基因的突变体株系,为着丝粒区域基因的功能研究提供了丰富的遗传材料。